Preview

Проблемы Эндокринологии

Расширенный поиск

Влияние многократных введений холецистокинина 26-33 на а- и р-клетки островков лангерганса в норме и при экспериментальном сахарном диабете типа 1

https://doi.org/10.14341/probl11424

Полный текст:

Аннотация

В исследованиях, проведенных на здоровых крысах и крысах с экспериментальным стрептозотоцининдуцированным сахарным диабетом типа 1, изучено влияние многократных периферических (интраперитонеальных) и центральных (интрацеребровентрикулярных) введений октапептида холецистокинина 26—33 (ХЦК-8) на функцию а- и /3-клеток островков Лангерганса. Выявление инсулина в /3-клетках и глюкагона в а-клетках осуществляли методом непрямой иммунофлюоресценции. Показано, что оба способа введения у здоровых животных приводят к угнетению секреции инсулина на фоне снижения потребления пищи. При этом центральное введение ХЦК-8 в отличие от периферического вызывает достоверный (р < 0,05) рост уровня гликемии и усиление продукции глюкагона в а-клетках. Введение пептида животным с диабетом, напротив, приводит к достоверному росту концентрации инсулина в крови (р < 0,05), снижению уровня гликемии (р < 0,05) и угнетению полифагии (р < 0,01), что связано с активацией функции /3-клеток и подавлением патологически высокой активности а-клеток. Установленные факты свидетельствуют о нарушении нейроэндокринных взаимодействий при сахарном диабете и подтверждают высказанные ранее предположения о важной роли холецистокинина в патогенезе этого заболевания.

Для цитирования:


Орловский М.А., Колесник Ю.М., Абрамов А.В. Влияние многократных введений холецистокинина 26-33 на а- и р-клетки островков лангерганса в норме и при экспериментальном сахарном диабете типа 1. Проблемы Эндокринологии. 2004;50(3):37-41. https://doi.org/10.14341/probl11424

For citation:


Orlovskii M.A., Kolesnik Yu.M., Abramov A.V. The effect of multiple injections of cholecystokinin 26-33 on a- and p-cells of islets of Langerhans normal and in experimental type 1 diabetes mellitus. Problems of Endocrinology. 2004;50(3):37-41. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11424

Исследованиями последних лет установлена важная роль одного из основных гуморальных ре­гуляторов пищевого поведения — холецистокини­на (ХЦК) — в стимуляции секреции инсулина [15, 17], а также доказано его участие в патогенезе са­харного диабета [3, 11, 16]. В настоящее время из­вестно, что молекула ХЦК, состоящая из 58 ами­нокислотных остатков, после секреции подвергает­ся ряду расщеплений с последовательным образо­ванием различных природных фрагментов, среди которых наибольшей биологической активностью обладают тетрапептид (30—33) и октапептид (26— 33) [3, 7]. Тетрапептид ХЦК (ХЦК-4) представляет собой конечный продукт процессинга ХЦК, актив­ный лишь в отношении рецепторов ХЦК 2-го типа (ХЦК2Я) [6, 9, 10], в то время как октапептид ХЦК (ХЦК-8) влияет как на 1-й (XHKjR), так и на 2-й тип рецепторов [3, 9, 14], являясь при этом основ­ной секретируемой формой ХЦК в мозге [5] и в окончаниях блуждающего нерва [7]. В наших пре­дыдущих работах показано, что развитие экспери­ментального сахарного диабета приводит к усиле­нию продукции ХЦК в гипоталамусе [2], а много­кратное интрацеребровентрикулярное и интрапе­ритонеальное введение ХЦК-4 крысам с диабетом ухудшает течение заболевания [1].

С целью определения роли ХЦК-8 в патогенезе сахарного диабета типа 1 мы изучили влияние мно­гократного интрацеребровентрикулярного и ин­траперитонеального введения этого фрагмента пептида на эндокринную функцию поджелудочной железы в норме и при экспериментальном диабете.

Материалы и методы

Исследование проведено на 80 половозрелых крысах линии Вистар. Все животные находились на стандартном рационе питания с ежедневным изме­рением количества потребляемой пищи. Сахарный диабет типа 1 моделировали однократным введени­ем стрептозотоцина ("Sigma Chemical", США) в до­зе 50 мг/кг внутрибрюшинно. Для изучения влия­ния ХЦК-8 на а- и р-клетки островков Лангерган­са использовали синтетический октапептид ХЦК 26—33 производства фирмы "Peninsula Laboratories Inc." (США). ХЦК-8 вводили ежедневно в течение 10 дней интраперитонеально (15 нмоль на 1 кг мас­сы тела в 1 мл 0,9% раствора NaCl) и интрацереб- ровентрикулярно (75 пмоль на 1 кг массы тела в 3 мкл 0,9% раствора NaCl). Введение пептида кры­сам с диабетом начинали на 25-е сутки после инъ­екции стрептозотоцина, так как уже к этому сроку у животных формировались все признаки сахарно­го диабета [1,4]. Для интрацеребровентрикулярных введений животным за 8 дней до начала экспери­ментов в правый латеральный желудочек мозга сте- реотаксически имплантировали стальную канюлю [12]. Контролем служили группы животных без диабета и с диабетом без введений, а также с вве­дениями эквивалентных количеств 0,9% раствора NaCl.

Через 24 ч после последнего введения пептида на фоне 16-часового голодания животных декапи- тировали под этаминаловым наркозом (40 мг/кг), быстро извлекали поджелудочную железу, которую после фиксации в жидкости Буэна и стандартной гистологической обработки заливали в парафин. Непосредственно перед забоем брали артериаль­ную кровь для определения концентрации инсули­на радиоиммунным методом с использованием на­бора рио-ИНС-ПГ-|251 (Институт биохимии НАН Республики Беларусь). Концентрацию глюкозы в периферической крови измеряли с помощью при­бора One Touch II® ("Life Scan", "Johnson and John­son”, США) через 16 ч после последнего приема пи­щи до начала введений ХЦК-8, а также непосред­ственно перед забоем.

Идентификацию р-клеток и количественное выявление инсулина в них осуществляли методом непрямой иммунофлюоресценции с использовани­ем набора фирмы "Peninsula Lab. Inc." (США) со­гласно прилагаемому протоколу. Для идентифика­ции а-клеток использовали первичные мышиные моноклональные антитела к глюкагону и вторич-

Таблица 1

Потребление пищи, концентрация глюкозы и инсулина в крови у экспериментальных животных (М ± т)

Животные

Потребление пищи, г на 1 кг массы тела

Уровень гликемии, ммоль/л

Концентрация инсулина в крови, нмоль/л

Интактные крысы

179,5 ± 8,7

3,54 ± 0,23

132,4 ± 5,9

Здоровые крысы, i. р. ХЦК-8

115,4 ± 10,1*

3,52 ± 0,23

94,5 ± 9,4*

Здоровые крысы, i. с. v. ХЦК-8

135,8 ± 19,2*

4,58 ± 0,37*

80,1 ± 16,7*

Крысы с диабетом

318,6 ± 32,0*

24,94 ± 2,70*

57,0 ± 5,5*

Крысы с диабетом, i. р. ХЦК-8

283,0 ± 21,8*’**

7,81 ± 2,24**

92,6 ± 11,8* **

Крысы с диабетом, i. с. v. ХЦК-8

204,4 ± 24,9**

14,42 ± 2,75*’**

92,3 ± 12,1*’**

При ме ча ние. Здесь и в табл. 2: i. р. — интраперитонеальное введение, i. с. v. — интрацеребровентрикулярное введение. Звездочки — достоверность (р < 0,05) различий: одна — с интактными животными, две — с животными с диабетом.

Таблица 2

Показатели а- и р-клеток островков Лангерганса у экспериментальных животных ± т)

UnATUkTP

Число клеток в площади

Показатели иммунореактивного материала в клетке

ZlVrl DO 1 Г1 DIV

среза островка

площадь, мкм2

концентрация, усл. ед.

содержание, усл. ед.

а-Клетки

Интактные крысы

20,92 ± 0,97

53,65 ± 0,54

3,66 ± 0,02

1143,2 ± 13,4

Здоровые крысы, i. р. ХЦК-8

20,84 ± 1,26

57,61 ± 0,56*

3,68 ± 0,02

1233,6 ± 14,2*

Здоровые крысы, i. с. v. ХЦК-8

20,53 ± 1,10

55,52 ± 0,57*

3,29 ± 0,02*

1050,7 ±11,8*

Крысы с диабетом

25,53 ± 1,88*

78,59 ± 0,48*

3,40 ± 0,02*

1558,1 ± 10,8*

Крысы с диабетом, i. р. ХЦК-8

19,85 ± 1,58**

59,80 ± 0,74**

2,93 ± 0,02* **

1026,7 ± 14,0*’**

Крысы с диабетом, i. с. v. ХЦК-8

17,35 ± 1,30*-**

54,93 ± 1,04*’**

р-Клетки

2,17 ± 0,01*’**

713,3 ± 14,6*’**

Интактные крысы

32,67 ± 2,53

85,52 ± 0,47

2,83 ± 0,01

1450,7 ± 10,3

Здоровые крысы, i. р. ХЦК-8

29,60 ± 4,27

121,89 ± 0,94*

3,65 ± 0,02*

2630,2 ± 24,9*

Здоровые крысы, i. с. v. ХЦК-8

32,26 ± 3,34

64,11 ± 0,77*

2,35 ± 0,01*

937,3 ± 13,6*

Крысы с диабетом

4,75 ± 0,31*

104,58 ± 2,14*

2,89 ± 0,05

1782,7 ± 50,1*

Крысы с диабетом, i. р. ХЦК-8

6,00 ± 0,54*’**

101,51 ± 2,35*

2,62 ± 0,02*’**

1597,2 ± 41,4*’**

Крысы с диабетом, i. с. v. ХЦК-8

4,41 ± 0,34*

86,61 ± 2,61**

2,56 ± 0,02* **

1345,2 ± 47,4*’**

ные кроличьи антитела к IgG мыши, конъюгиро­ванные с FITC ("Sigma Chemical’’, США).

Изображения островков, получаемые на микро­скопе AXIOSKOP ("Zeiss”, Германия), с помощью высокочувствительной видеокамеры COHU-4722 вводили в систему анализа изображений VIDAS- 386 ("Kontron Elektronik", Германия). В дальней­шем с помощью специальной программы в полу­автоматическом режиме измеряли среднее количе­ство а- и р-клеток в площади среза островка Лан­герганса, а также площадь, занятую иммунореак­тивным к гормону материалом, кон­центрацию и содержание инсулина и глюкагона. Значения этих показате­лей использовали для оценки актив­ности процессов синтеза и секреции гормона в клетках.

Микрофотографии получали с помощью видеопринтера СР 100 ("Mitsubishi”, Япония). Достовер­ность различий оценивали по /-кри­терию Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Проведенные исследования по­казали, что многократное интрапе­ритонеальное и интрацеребровен- трикулярное введение физиологиче­ского раствора здоровым крысам и животным с диабетом не вызывало достоверных изменений изучаемых нами показателей.

Интраперитонеальное введение ХЦК-8 в течение 10 дней вызывало достоверное снижение потреб­ления пищи, что сочеталось с уменьшением концентрации инсулина в сыворотке крови (табл. 1). В р-клетках достовер­но увеличивались площадь, концентрация и содержание гормона (табл. 2). Это, по всей видимости, свидетельствовало о торможении секреции инсу­лина и накоплении его в цито­плазме р-клеток, что хорошо видно на приведенной микро­фотографии (рис. 1, б). В ос- клетках отмечали практически аналогичные изменения, также свидетельствующие о торможе­нии секреции глюкагона. Дос­товерных изменений концен­трации глюкозы в крови не от­мечено.

Многократные интрацеребро- вентрикулярные введения ХЦК-8, как и интраперитонеальные вве­дения, вызывали снижение по­требления пищи, однако при этом концентрация инсулина в крови уменьшалась в большей степени, а уровень гликемии достоверно возрастал. В р-клет­ках происходило достоверное снижение всех изу­чаемых показателей, что выражалось в уменьше­нии площади клетки и интенсивности флюорес­ценции, хорошо видимых на микрофотографии (рис. 1, в). По всей видимости, причина этих изме­нений связана с угнетением не только секреции, но и синтеза инсулина. В а-клетках наблюдали досто­верное увеличение площади и снижение концен­трации глюкагона, что свидетельствовало о стиму­ляции его секреции и являлось причиной повыше­ния концентрации глюкозы в крови.

Таким образом, нами показано, что многократ­ное введение ХЦК-8 здоровым животным в отли­чие от описанных в литературе стимулирующих эффектов однократного введения [13] подавляло продукцию инсулина в р-клетках, что могло быть следствием длительной анорексии [8], обусловлен­ной влиянием изучаемого нами пептида. Кроме то­го, разные способы введения ХЦК-8 оказывали разнонаправленное действие на а-клетки остров­ков Лангерганса, снижая секрецию глюкагона при периферическом введении и стимулируя — при центральном.

Развитие сахарного диабета к концу 5-й недели вызывало снижение массы тела, развитие полифа­гии в сочетании с гипергликемией и выраженной гипоинсулинемией. В островках значительно умень­шалось количество р-клеток и увеличивалось коли­чество а-клеток (рис. 2, а). В сохранившихся р-клет­ках компенсаторно увеличивались площадь и содер­жание инсулина (рис. 3, а). В а-клетках достоверно возрастали площадь, содержание и снижалась кон­центрация глюкагона, что свидетельствовало о ха­рактерной для сахарного диабета активации синтеза и секреции глюкагона в островках Лангерганса.

При сахарном диабете интраперитонеальные вве­дения ХЦК-8 снижали гиперфагию и приводили к достоверному увеличению концентрации инсулина в крови и снижению уровня гликемии. Данные из­менения были связаны с усилением секреции инсу­лина в р-клетках, о чем свидетельствовало снижение в них концентрации и содержания гормона (рис. 3, б). В определенной мере этому также способствова­ло уменьшение количества а-клеток в островках и торможение в них синтеза и секреции глюкагона, что проявлялось достоверным снижением всех изу­чаемых показателей (рис. 2, б; см. табл. 2).

Центральное введение ХЦК-8 приводило к дос­товерному повышению концентрации инсулина в крови, однако снижало уровень гликемии в меньшей степени, чем при периферическом введении (см. табл. 1). Данные изменения могли быть связаны со стимуля­цией секреции инсулина в р-клет­ках (см. табл. 2), проявлявшейся уменьшением площади гормона до уровня интактных животных и снижением концентрации и со­держания инсулина в них (рис. 3, в), а также снижением количества а-клеток в островках Лангерган­са, уменьшением площади, со­держания и концентрации глюка­гона (рис. 2, в). Установленный положительный эффект мог быть также связан с угнетением по­требления пищи, которое было выражено в большей степени, чем при интраперитонеальном введе­нии ХЦК-8 (см. табл. 1).

Таким образом, многократное введение ХЦК-8 в отличие от ХЦК-4 [1] оказывало положи­тельное влияние на течение са­харного диабета, что проявля­лось повышением концентрации инсулина в кро­ви, снижением уровня гликемии и угнетением по­лифагии. Это связано с тем, что оба способа вве­дения активировали функцию р-клеток и подавля­ли патологически высокую активность а-клеток.

Выводы

  1. Многократные введения ХЦК-8 оказывают влияние на функцию а- и р-клеток островков Лан­герганса, что проявляется изменением площади, содержания и концентрации гормонов в них, кото­рые зависят от способа введения пептида, а также от состояния животных.

Многократные центральные и перифериче­ские введения ХЦК-8 у животных с сахарным диа­бетом типа 1 улучшают течение заболевания, что выражается в снижении гликемии, стимуляции секреции инсулина и подавлении патологически высокой продукции глюкагона.

Список литературы

1. Абрамов А. В. И Ендокринолопя. — 1997. — Т. 2, № 2. — С. 36-40.

2. Абрамов А. В., Колесник Ю. М., Тржецинский С. Д., Орловский М. А. // Морфология. — 1998. — Т. 144, № 6. — С. 27-31.

3. Громов Л. А. Нейропептиды. — Киев, 1992.

4. Колесник Ю. М., Абрамов А. В., Траилин А. В., Тржецинский С. Д. // Пробл. эндокринол. — 1999. — Т. 45, № 2. — С. 42-45.

5. Adeghate Е. // Neuropeptides. — 1999. — Vol. 33, N 3. — Р. 227-235.

6. Akiyoshi J., Moriyama T., Isogawa К. et al. // J. Neurochem.1996. - Vol. 66. - P. 1610-1616.

7. Chang T., Thagesen H., Lee К Y. et al. // Regulat. Peptides.2000. - Vol. 87. - P. 1-7.

8. Felig P., Baxter D., Frohman L. A. Endocrinology and Metabolism. — New York, 1995.

9. Ferraro L., Beani L., Trist D. et al. // J. Neurochem. — 1999. -Vol. 73, N 5. - P. 1973-1981.

10. Fink Н., Rex A., Voits М., Voigt J. Р. // Exp. Brain Res. — 1998. - Vol. 123, N 1-2. - Р. 77-83.

11. Miyasaka К., Ohta М., Kanai S. et al. // Pancreas. — 1996. — Vol. 12, N4. - P. 351-356.

12. Paxinos G. B., Watson С. C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. — Sydney, 1986.

13. Rodriguez-Gallardo J., Silvestre R. A., Marco J. // Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. - 1999. - Vol. 23, N 8. - P. 787- 792.

14. Schutte I. W., Akkermans L. M., Kroese A. B. // J. Auton. Nerv. Syst. - 1997. - Vol. 67, N 1-2. - P. 51-59.

15. Tachibana I., Akiyama T, Kanagawa K. et al. // Am. J. Physiol. - 1996. - Vol. 270, N 4, Pt 1. - P. G730-G737.

16. Takiguchi S., Takata Y., Takahashi N. et al. // Ibid. — 1998. - Vol. 274, N 2, Pt 1. - P. E265-E270.

17. Verspohl E. J., Herrmann K. // Ibid. — 1996. — Vol. 271, N 1, Pt 1. - P. E65-E72.


Об авторах

М. А. Орловский

Запорожский государственный медицинский университет


Украина


Ю. М. Колесник

Запорожский государственный медицинский университет


Украина


А. В. Абрамов

Запорожский государственный медицинский университет


Украина


Для цитирования:


Орловский М.А., Колесник Ю.М., Абрамов А.В. Влияние многократных введений холецистокинина 26-33 на а- и р-клетки островков лангерганса в норме и при экспериментальном сахарном диабете типа 1. Проблемы Эндокринологии. 2004;50(3):37-41. https://doi.org/10.14341/probl11424

For citation:


Orlovskii M.A., Kolesnik Yu.M., Abramov A.V. The effect of multiple injections of cholecystokinin 26-33 on a- and p-cells of islets of Langerhans normal and in experimental type 1 diabetes mellitus. Problems of Endocrinology. 2004;50(3):37-41. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11424

Просмотров: 132


ISSN 0375-9660 (Print)
ISSN 2308-1430 (Online)