Ассоциация инсулинзависимого сахарного диабета и аллелей локуса HLA-DQA1

Инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД) является мультифакториальным заболеванием с выраженной генетической предрасположенностью, которая определяется генами II класса главного комплекса гистосовместимости (HLA). В популяциях белой расы была показана сильная ассоциация ИЗСД с HLA DR3 и О1<4-антигенами [2]. При этом для гетерозигот DR3/DR4 отмечался значительно более высокий риск развития заболевания, чем для гомозигот DR3/DR3 или DR4/DR4 [5], что свидетельствовало в пользу существования двух генов, ответственных за предрасположенность к диабету и действующих синергично. Это нс могли быть собственно гены локуса HLA DR, поскольку продукты генов, определяющих серологические фенотипы DR3 и DR4, не образуют между собой гибридных молекул.

Новое поколение молекулярно-генетических методов, связанных с появлением методики полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволило на уровне ДНК исследовать полиморфизм генов гистосовместимости [7J. Было показано неравновесие по сцеплению между аллелями близко расположенных локусов HLA, в частности DR и DQ [11]. Гены HLA DQ оказались единственным генетическим маркером, для определенных аллелей которого была не только доказана сильная ассоциация с ИЗСД в большинстве изученных популяций, но и обнаружена корреляция между частотой данных аллелей в популяции и заболеваемостью в ней диабетом [6].

Сравнение нуклеотидных последовательностей генов HLA DQA1 и DQB1 у больных ИЗСД и здоровых индивидуумов [9, 13], а также исследования на животных моделях |1] показали, что с ИЗСД ассоциируют аллели этих генов, кодирующих замену аспарагиновой кислоты в положении 57 DQP-цепи (DQB1 He-Asp57 аллели) и аргинин в положении 52 DQa-цепи (DQA1 Arg52 аллели). Присутствие у индивидуума обоих этих предрасполагающих аллелей приводит к образованию у него “диабетогенных” гетеродимсров (DQa Arg52/DQP He-Asp57), причем у гстерози- гот такие гстсродимсры могут формироваться из продуктов DQA1- и DQB1-генов, находящихся в разных (гомологичных) хромосомах 112]. Нс исключено, что гомозиготность по наиболее “опасным” с точки зрения развития ИЗСД аллелям может с большей вероятностью приводить к заболеванию или индуцировать заболевание в более ранний период или в более тяжелой форме.

Некоторые из существующих в настоящее время гипотез, касающихся генетической предрасположенности к ИЗСД, нс вполне убедительны, и накопленные новые экспериментальные данные в ряде случаев с ними не согласуются. Например, нс всегда имеются убедительные свидетельства того, что все Arg52 аллели гена DQA1 в равной степени ответственны за увеличение риска развития диабета. Остается открытым и не до конца ясным вопрос, достаточно ли для предрасположенности к заболеванию присутствия в геноме одного “диабетогенного” аллеля. Появились данные о том, что, возможно, большую роль играют “защитные” аллели, отрицательно ассоциирующие с заболеванием [3, 8]. Для выяснения этих вопросов мы использовали как традиционное сравнение частот аллелей в выборках больных ИЗСД и здоровых доноров, так и некоторые данные семейного анализа.

В настоящей работе ставились следующие основные задачи:

• сравнить частоты аллелей гена HLA DQA1 у больных и здоровых и выявить аллели, положительно и отрицательно ассоциирующие с диабетом;
• проверить, достаточно ли для предрасположенности к ИЗСД наличия одного ассоциирующего с заболеванием аллеля;
• проверить гипотезу о том, что в DQAa-цепи за предрасположенность к диабету ответственен Arg

Материалы и методы

Были обследованы и генотипировапы 51 больной ИЗСД. а в 31 семье - также родственники больного (54 человека). В контрольную группу вошли 57 здоровых доноров.

Для получения ДНК использовали венозную кровь, которую брали с консервантом следующего состава: 0,48% лимонной кислоты, 1,32% цитрата натрия, 1,47% глюкозы.

ДНК из крови выделяли методом фенол-хлороформной экстракции, предложенным В. Lindblom и G. Holmund [10].

Разделение аллелей гена HLA DQA1 проводили путем амплификации in vitro вариабельного 2 экзона этого гена с последующей обработкой амплификата рестриктазами НасШ, Rsal, Fold и Ddel и дополнительно определяли делению грех нуклеотидов, присутствующую в аллелях *0201, *0401. *0501, *0601. Данный метод полимеразной цепной реакции - полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР - ПДРФ) позволяет без применения олигонуклсотидных зондов, процедуры мечения и гибридизации определять 7 различных аллельных состояний гена DQA1 из 8 известных (не разделяя аллели *0101 и *0102). Для амплификации использовали следующие праймеры:

5' = GCCTCTTACGGTGTAAACTTG

5' = ATTGGTAGCAGCGGTAGAGTT.

Таблица 1

Частоты аллелей гена HLA DQA1 у здоровых доноров, у больных ИЗСД и членов их семей

Для проведения ПЦР применяли программируемый термоциклер РНС-2 фирмы “Teclme”. пЦр с использованием термостабильной ДНК-полимеразы Biotag производства СП “Биомастер” проводили в буфере следующего состава: 16,6 мМ сульфат аммония; 67,0 мМ трис-HCl pH 8,8; 1,5 мМ хлорид магния; 0,01% твин-20. Амплификациониая смесь содержала по 0,5 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 2-3 ед, полимеразы Biotag и 0,11 мкг геномной ДНК, К смеси добавляли 30-50 мкл вазелинового масла и проводили 28 циклов ПЦР со следующими параметрами: 94'С - 45 с, 50°С — 45 с, 72"С - 60 с,

Результаты ПЦР-ПДРФ оценивали после проведения электрофореза в 8% полиакриламидном геле, с последующим прокрашиванием в растворе бромистого этидия (концентрация 1 мг/мл); в качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК плазмиды pBR322, рестрицированную НаеШ,

Для статистической оценки достоверности различий по частоте встречаемости отдельных аллелей в двух сравнива- емых'выборках применяли f-критерий Стьюдснта,

Результаты и их обсуждение

По предлагаемой схеме определения аллелей гена HLA DQA1 были генотипированы 57 неродственных человек, не страдающих ИЗСД, 51 больной ИЗСД, а также члены семей 31 больного сахарным диабетом. Полученные частоты аллелей гена DQA1 представлены в табл.1.

У больных ИЗСД повышена частота аллеля DQA1 *0301 и снижена частота аллеля *0201 по сравнению с контролем (р_с < 0,001), а частоты этих аллелей у родственников больных, как и ожидалось, имеют промежуточные значения. Среди аллелей гена hLa DQA1 аргинин в положении 52 кодируют *0301, *0401, *0501 и *0601, из них аллель *0301 кодирует два аргинина подряд — Arg52 и Arg53. Из табл.1 следует, что за предрасположенность к ИЗСД ответствен аллель DQA1 *0301, наиболее отличающийся от остальных в районе аминокислоты 52. В гене HLA DQB1 из He-Asp57 аллелей наиболее отличается от других в области “ключевой” 57 аминокислоты аллель DQB1 *0201. Именно для этих аллелей в европейских популяциях наблюдается неравновесие по сцеплению с DR4 (DQA1 *0301) и DR3 (DQB1*0201).

С целью проверки гипотезы о критическом значении Arg52 для предрасположенности к диабету нами проведен анализ ассоциации заболевания с Arg52 и He-Arg52 аллелями. Результаты этого анализа представлены в табл.2.

В сравниваемых группах наблюдается различие по частоте аллеля DQA1 *0301, но не обнару-

Таблица 2

Частоты Arg52 и HC-ArgS2 аллелей гена HLA DQA1 у здоровых доноров, у больных ИЗСД и членов их семей

Таблица 3

Частоты встречаемости различных аллелей гена HLA DQA1 среди больных ИЗСД и здоровых лип

* рс — с поправкой на число определяемых аллелей гена DQA1,

Таблица 4

Частоты встречаемости Arg52 и He-Arg52 аллелей гена HLA DQA1 среди больных ИЗСД и здоровых лип

живаются различия по частотам других Arg52 аллелей, и, вероятно, отмеченная в ряде работ ассоциация Arg52 аллелей с ИЗСД обусловлена главным образом (или исключительно) ассоциацией заболевания с аллелем DQA1 *0301.

Если допустить, что для предрасположенности к диабету важно наличие' лишь одного “.диабетогенного” аллеля, то анализ частоты встрсчаемос- ти индивидуумов-носителей данного аллеля должен выявить более очевидные закономерности (табл.З).

Аналогичный анализ был проведен и для Arg52 и He-Arg52 аллелей гена HLA DQA1. Результаты приведены в табл.4.

Из 51 больного 40 имели аллель *0301, из них лишь 3 (7,5%) были гомозиготны по данному ал- лслю. В контрольной выборке наблюдалось такое же соотношение гомозигот и гетсрозигот по аллелю *0301 (7,7%). Следовательно, можно практически исключить гипотезу о том, что гомозиготы по аллелю *0301 в большей степени подвержены диабету, чем гстсрозиготы. Этот факт представляется интересным в свете имеющихся в настоящее время данных, что для стимулирования Т-клеточного ответа достаточно очень небольшого количества гстеродимсров подходящего типа [4].

В ы в о д ы

1. У больных диабетом наблюдается повышенная частота аллеля HLA DQA1 *0301 по сравнению со здоровыми людьми и не отмечается увеличения частот других Arg52 аллелей DQA
2. Среди пациентов с ИЗСД не наблюдается повышения встречаемости гомозигот по аллелю DQA1 *0301.
3. Присутствие He-Arg52 аллелей и особенно *0201 снижает риск возникновения заболевания.