Низкая экспрессия Mеt-гепатоцитарного рецептора фактора роста как показатель плохого прогноза при опухолях щитовидной железы

Молекулярно-генетическая диагностика опухо лей получила широкое признание только в этом де сятилетии, и ее отдельные направления развиты неодинаково. Более того, многие методы только начинают переносить из области фундаментальных исследований в клиническую практику [1]. Обна ружение какого-либо маркера в опухолевом мате риале позволяет проводить дальнейший монито ринг всего процесса канцерогенеза, а именно, оце нивать наличие остаточных опухолевых клеток по сле операции или химиотерапии и за несколько ме сяцев предсказывать появление метастазов или ре цидива опухоли. Известно, что чаще рак щитовид ной железы происходит из фолликулярного эпите лия, в том числе и хорошо-дифференцированные опухоли с папиллярным или фолликулярным строением. В странах с адекватным потреблением йода населением частота папиллярного рака со ставляет приблизительно 80% всех дифференциро ванных опухолей щитовидной железы [2, 7]. Ана логичная картина свойственна и России, где на до лю папиллярного рака, по данным разных авторов, приходится от 65 до 85%. Большинство опухолей имеют бессимптомное развитие и длительное вре мя остаются нераспознанными. Следует отметить, что только 10-15% папиллярного рака приводит к гематогенному метастазированию. Молекулярные расстройства в дифференцированных опухолях с метастатическим фенотипом неизвестны, хотя наиболее часто в них обнаруживаются мутации ras- онкогенов [6]. До настоящего времени, однако, ни один из известных молекулярных механизмов не имел практического клинического значения. В связи с этим представляется интересным анализ экспрессии Met-гепатоцитарного рецептора фак тора роста (Met/HGF-R) в ткани новообразований щитовидной железы, поскольку в литературе име ются данные о том, что Met/HGF-R определяется почти в 70% папиллярного и 25% фолликулярного рака. Данный факт дает возможность предполо жить, что Met/HGF-R играет роль в патогенезе ра ка щитовидной железы. Met-протоонкоген кодиру ет рецептор к фактору роста гепатоцитов (скаттер- фактору) и представляет собой гетеродимер мол. массой около 190 кД, состоящий из 2 связанных дисульфидными мостиками субъединиц - аир. а-Субъединица - это экстрацеллюлярный глико зилированный протеин, а [3-субъединица имеет экстрацеллюлярный домен, трансмембранный сег мент и цитоплазматический компонент - тиро- зинкиназу, активность которой регулируется фос форилированием. Фактор роста гепатоцитов, свя зываясь с Met, усиливает активность рецепторной тирозинкиназы путем аутофосфорилирования ос татка тирозина р-субъединицы [10]. Активация Met происходит при амплификации гена или при нару шении расщепления молекулы-предшественника на 2 субъединицы, а экспрессия этого онкогена об ратно пропорциональна агрессивному биологиче скому поведению опухоли и высокому риску мета стазирования. В эксперименте на культуре клеток было показано, что повышенная экспрессия Met часто возникает без наличия структурных анома лий этого гена и является результатом активации онкогенов ret и ras. В доброкачественных опухолях и нормальной тиреоидной ткани Met не определя ется, однако 1-3% стромальных клеток доброка чественных образований демонстрируют наличие фактора роста гепатоцитов. Повышенная экспрес сия Met не является специфичной для карцином щитовидной железы, она выявляется также при га строинтестинальных и гепатоцеллюлярных карци- номах, нейрогенных опухолях [4]. Met/HGF-R наиболее выражен в эпителиальных клетках, и его экспрессия пропорционально возрастает в клетках рака толстой кишки, поджелудочной железы, яич ника, предстательной железы, костной ткани и же лудка [8]. Мы оценивали степень экспрессии Met/ HGF-R в ткани доброкачественных и злокачест венных опухолей щитовидной железы при помощи иммуногистохимического метода. Материалы и методы Пациенты. Ретроспективное изучение Met/ HGF-R было проведено в 212 образцах опухолей щитовидной железы, заключенных в парафиновые блоки: 163 из них были раком щитовидной железы фолликулярного происхождения (129 папилляр ных, 21 фолликулярных и 13 анапластических), 49 - аденомами щитовидной железы и 50 пред ставляли собой ткань узловых зобов. Пациенты пе ренесли операцию на щитовидной железе в ЭНЦ РАМН в 1995-1999 гг. и в Медицинском универ ситете г. Катания (Италия) в 1984-1991 гг. Были отобраны больные, перенесшие тотальную тирео идэктомию с удалением паратрахеальных лимфа тических узлов (Италия, 96 больных, включая все случаи анапластических раков), и больные, пере несшие предельно субтотальную тиреоидэктомию, сопряженную с удалением лимфатических узлов (Россия, 67 больных). Тотальная тиреоидэктомия бьша выполнена 96 пациентам из Италии на основе исходного цитологического диагноза рака щито видной железы. Практически все включенные в ис следование аденокарциномы, выявленные в Рос сии, существовали на фоне зобных изменений щи товидной железы. Среди 49 пациентов с доброка чественными опухолями щитовидной железы было 9 больных с автономно функционировавшими фолликулярными аденомами и 40 эутироидных больных с фолликулярными аденомами. Все боль ные, оперированные по поводу дифференцирован ного рака щитовидной железы, были вызваны для контрольного обследования, включающего в себя клинический осмотр, ультразвуковое исследование щитовидной железы (шеи), гормональное исследо вание, определение уровня тиреоглобулина. В том случае, если при отсутствии остаточной ткани щи товидной железы концентрация тиреоглобулина у пациента с повышенным уровнем тиреотропного гормона (на фоне отмены тироксина) была больше, чем 5 г/л (иммунорадиометрический метод опреде ления), можно было говорить о наличии метаста тической ткани. В большинстве случаев отдален ные метастазы были выявлены при стандартном рентгенологическом обследовании или компью терной томографии. Диагноз метастазов в лимфа тические узлы основывался на данных ультразву кового исследования шеи и тонкоигольной аспи рационной биопсии с цитологическим исследова нием. Образцы ткани щитовидной железы. Использо вали образцы ткани опухолей щитовидной железы, заключенные в парафин, и контрольные образцы- срезы окружающей узлы ткани щитовидной желе зы (стандарт), окрашенные гематоксилином и эозином. Все образцы ткани были дважды иссле дованы независимыми морфологами (в России и в Италии), оценивали размер опухоли, ее гистологи ческий тип, экстратиреоидное распространение, наличие сосудистой инвазии и поражения лимфа тических узлов. Исследование Met/HGF-R AHrnu-rnet/hgf-r-антитела. Для исследования ис пользовали антитела класса scl61 (Santa Cruz-био- технология, Santa Cruz) - иммуноглобулины кро лика против синтетического белка, у которого 12 последних аминокислот соответствуют 12 послед ним аминокислотам человеческого Met/HGF-R [10]. Оптимальная концентрация иммуноглобули на, примененная для иммуноокрашивания, состав ляла 0,5% г/мл, что достигалось последовательны ми разбавлениями. Иммуногистохимическое окрашивание. Заклю ченные в парафин срезы ткани щитовидной желе зы были депарафинированы 3% раствором переки си водорода и обработаны с помощью биотин- стрептавидин-пероксидазного метода [10]. Затем срезы были инкубированы с вышеописанными ан тителами при комнатной температуре 60 мин, по сле этого соединены со вторичными антителами (биотинированный иммуноглобулин) и комплек сом стрептавидин-биотина. Контрокрашивание выполняли с гематоксилином Майера [5]. Оценка иммуногистохимического окрашивания. Пропорцию окрашенных клеток определяли на ос нове оценки всего предметного стекла и обознача ли следующим образом: 0 (нет ни одной окрашен ной клетки), 1 (до 1% окрашенных клеток), 2 (1- 10% окрашенных клеток), 3 (10-33% окрашенных клеток), 4 (33-66% окрашенных клеток) и 5 (более 66% окрашенных клеток). Интенсивность положи тельно окрашенных клеток была обозначена сле дующим образом: 0 (отрицательная), 1 (очень сла бая), 2 (слабая), 3 (умеренная), 4 (сильная) и 5 (очень сильная). Пропорция и степень интенсив ности были затем объединены в показатель общего диапазона от 0 до 10. Окрашивание расценивали как отрицательное, если общий диапазон был ра вен 0, и как достоверно положительное, если диа пазон был от 2 до 10. Иммуноокрашивание было оценено двумя независимыми исследователями, которые не знали исходных клинических данных пациентов. В том случае, если они делали различ ные заключения, истинным считали более низкую степень окрашивания. Расхождения в оценке окра шивания при слепом контроле 50 случаев состави ли менее 3%. Прогностическое значение экспрес сии Met/HGF-R, а также ряда клинических пока зателей оценивали методами единовариантного и многовариантного анализа согласно пропорцио нальной модели регрессии опасностей Коха [5]. Результаты и их обсуждение В фиксированных парафином срезах ткани ра ков щитовидной железы иммунореактивность Met/ HGF-R была найдена как в цитоплазме, так и в клеточной мембране. Иммунореактивность Met/ HGF-R была представлена исключительно в эпи телиальных опухолевых клетках. В ткани щитовид ной железы, окружающей опухоль, Met/HGF-R не выявляли, за исключением случайных и слабоок- рашенных фолликулов. Таблица 1 Полуколичествснная оценка наличия Met/HGF-R в опухолях щитовидной железы (иммуногистохимический метод) Тип опухоли Число на- блюде- ний Экспрессия Met/HGF-R нет (0) низкая (2-5) высокая (6-10) Злокачественная: папиллярная 129 12 (9,3) 43 (33,3) 74 (57,4) фолликулярная 21 12 (57,1) 9 (42,9) 0 анапластическая 13 6 (46,1) 7 (53,8) 0 Доброкачественная аденома автономная 9 0 8 (88,9) 1 (11,1) фолликулярная 33 12 (36,4) 21 (63,6) 0 атипичная* 7 4(57,1) 3 (42,9) 0 Примечание. Здесь и в табл . 2, 3: в скобках - процент. * - аденома с ядерным атипизмом. Экспрессия Met/HGF-R Папиллярный рак. Высокую экспрессию Met/ HGF-R наблюдали исключительно в папиллярных раках, что объясняется ролью HGF-MET/HGF-R- системы в биологии этого типа рака щитовидной железы. Кроме того, при папиллярном раке отри- цательная/низкая экспрессия Met/HGF-R была наиболее эффективным показателем гематогенно го метастазирования. 117 из 129 исследованных ра ков демонстрировали Met/HGF-R-иммунореак- тивность: 74 (57,4%) имели интенсивное и гомо генное окрашивание, 43 (33,3%) - фокально-по ложительное окрашивание; у 12 (9,3%) был полу чен отрицательный вариант окрашивания. Фолликулярный рак. Ни один из 21 фолликуляр ного исследованного рака не имел интенсивного окрашивания, у 7 (42,9%) было выявлено фокаль но-положительное окрашивание и у 12 (57,1%) был получен отрицательный вариант (табл. 1). Анапластический рак. Анапластический рак был или Met/HGF-R-отрицательный 6 (46,1%), или имел фокально-положительное окрашивание (53,8%; см. табл. 1). Аденомы. Окрашивание Met/HGF-R было ин тенсивным в 49 аденомах щитовидной железы, фо кально представлено в 32 и не определялось в 16 случаях. В наибольшей степени оно выявлялось в автономно функционирующих аденомах по срав нению с остальными изученными вариантами (р = 0,011). Послеоперационный мониторинг. Из 129 пациен тов с папиллярным раком щитовидной железы 9 не явились на контрольное обследование и были ис ключены из дальнейшего анализа: 5 из них были в группе с отрицательным/низким окрашиванием Met/HGF-R и 4 - в группе с высоким Met/HGF- R-окрашиванием. Ни один из них не имел отда ленных метастазов во время исходного обследова ния. Время наблюдения за остальными пациента ми с дифференцированными раками щитовидной железы (120 папиллярных и 21 фолликулярный) составило 5,5 лет. Связь между Met/HGF-R и другими параметрами. Все пациенты с папиллярным раком щитовидной железы были разделены на 2 подгруппы: 1-я с от рицательным/низким Met/HGF-R (л = 50), 2-я с высоким выражением экспрессии Met/HGF-R (« = 70). Клинические и гистопатологические ха рактеристики этих групп суммированы в табл. 2. Папиллярный рак в этих 2 группах не различал ся по диаметру опухоли, ее гистологическому типу, экстратиреоидному распространению или метаста зированию в лимфатические узлы. Папиллярный рак с отрицательным/низким Met/HGF-R сочетал ся с наличием сосудистой инвазии (18,0% против 4,3% в противоположной группе; р = 0,0308) и от даленными метастазами в отличие от опухолей, имевших высокий Met/HGF-R (10,0% против 0%; р = 0,0251). Рецидивы рака были более частыми в группе с отрицательным/низким Met/HGF-R, чем в группе с высоким Met/HGF-R (р = 0,0248; табл. 3). Наличие метастазирования в лимфатиче ские узлы (88% против 55,7%) и отдаленного мета стазирования (28,0% против 2,2%) было значитель но выше в группе с отрицательным/низким Met/ HGF-R, чем в группе с высоким Met/HGF-R (р = 0,0002; см. табл. 3). 18 (36%) из 50 пациентов, которые умерли от рака на момент заключительно го обследования, характеризовались отрицатель ным/низким Met/HGF-R, тогда как в группе с вы соким Met/HGF-R такой исход был только у 7 (10%) из 70 больных (р = 0,0012; см. табл. 3). У больных фолликулярным раком наблюдалось 6 случаев отдаленного метастазирования и 1 пациент умер. Статистически значимой связи между нали- Табл ица 2 Связь между экспрессией Met/HGF-R и клинико-морфологиче скими показателями у больных с папиллярным раком щитовидной железы Показатель Отрицательный/ низкий Met/ HGF-R (п = 50) Высокий Met/HGF-R (л = 70) Р Пол: женский 41 (82,0) 60 (85,7) нд мужской 9 (18,0) 10 (14,3) Возраст, годы: < 45 32 (64,0) 47 (67,1) нд > 45 18 (36,0) 23 (32,9) Диаметр опухоли, см < 1 8 (26,0) 16 (22,9) 1,1-4 35 (70,0) 49 (70,0) нд > 4 7 (14,0) 5 (7,1) Мультифокальная опухоль: нет 34 (68) 42 (60) нд да 16 (32) 28 (40) Билатеральная опухоль: нет 37 (74,0) 55 (78,6) нд да 13 (26,0) 15 (21,4) Экстратиреоидное распро странение: нет 27 (54,0) 43 (61,4) да 23 (46,0) 27 (38,6) нд Метастазы в лимфатиче ские узлы: нет 20 (40,0) 39 (55,7) да 30 (60,0) 31 (44,3) нд Сосудистая инвазия: нет 41 (82,0) 67 (95,7) да 9 (18,0) 3 (4,3) 0,0308 Отдаленные метастазы: нет 45 (90,0) 70 (100) да 5 (10,0) 0 (0) 0,0251 Примечание. Здесь и в табл. 4 и 5: "нет" - отсутствие признака, "да" - наличие признака, нд - недостоверно. Таблица 3 Данные динамического наблюдения за больными с папиллярным раком щитовидной железы с отрицательным/низким или высоким Met/HGF-R Показатель Число пациентов с негативным или низким Met/ HGF-R (л = 50) Число пациен тов с высоким Met/HGF-R (л = 70) Р Метастазы в лимфатиче- с кие узлы: исходно 30 (60,0) 31 (44,3) 0,1304 появились за период наблюдения 14 (28,0) 8 (11,4) 0,0948 всего 44 (88,0) 39 (55,7) 0,0002 Отдаленные метастазы: исходно 5 (Ю) 0 0,0251 появились за период наблюдения 9 (18) 2 (2,2) 0,0248 всего 14 (28) 2 (2,2) 0,0002 Исход: больные без рецидива (условно здоровые) 32 (64,0) 63 (90) больные с рецидивом 15 (30,0) 6 (8,6) умерли от рака 3 (6,0) 1 (1,4) 0,0025 чием Met/HGF-R и отдаленным метастазировани ем не выявлено. Одновариантный анализ. Анализировали те слу чаи папиллярного рака, в которых Met/HGF-R от сутствовал, и те случаи фолликулярного рака, в ко торых он был фокально выражен. Одновариантный анализ Коха показал, что риск развития отдален ного метастазирования был выше у больных с опу холями при отрицательном/низком Met/HGF-R, чем у пациентов с высоким Met/HGF-R (д = 0,0011). Сосудистая инвазия опухоли (р = 0,0000), возраст старше 45 лет (р = 0,0140), экстратиреоидное рас пространение опухоли (р = 0,0073), и диаметр опу холи более 4 см (р = 0,01352) также свидетельство вали об увеличении риска отдаленного метастази рования. Коэффициенты опасности такого риска представлены в табл. 4. При этом в представленном ряде только в 2 из 70 случаев больные с высокой экспрессией Met/HGF-R* имели отдаленные мета стазы. У этих 2 пациентов из Италии были и другие факторы риска, а именно возраст и пол (мужчины 59 и 60 лет), запущенное заболевание, характери зующееся обширной инвазией опухоли в трахею. Другие параметры, включая пол, инфильтрацию капсулы, мультифокальность, билатеральность и наличие метастатических лимфатических узлов, практически не были связаны с развитием отдален ного метастазирования. Многовариантный анализ. Получена пропорцио нальная модель опасности, в которой 4 параметра независимо связаны с вероятностью развития от даленного метастазирования опухоли: отрицатель- ный/низкий Met/HGF-R (р - 0,0036), экстрати реоидное распространение опухоли (р = 0,0181), возраст (младше и старше 45 лет; р = 0,0099) и со судистая инвазия (д = 0,0358). Коэффициенты опас ности представлены в табл. 5. Наиболее ценным в клинической практике пред ставляется определение экспрессии Met/HGF-R для оценки прогноза у больных с папиллярным ра ком щитовидной железы. Известно, что папилляр ные раки метастазируют в региональные лимфати ческие узлы в 40-60% случаев, но только в 10- Таблица 4 Одновариантный анализ пациентов с папиллярным раком щито видной железы в соответствии с клинико-патологическими кри териями и выраженностью экспрессии Met/HGF-R Отдаленное метастазирование Критерий коэффициент опасности интервал 95% дове рительности Р Met/HGF-R: высокий 1,00 негативный/низкий Сосудистая инвазия: 11,86 2,69-52.31 0.0011 нет 1,00 да 10,20 3,78-27,52 0,0000 Экстратиреоидное распространение: нет 1,00 да 4,71 1,52-14,62 0,0073 Возраст, годы: < 45 1,00 > 45 3,56 1,29-9,79 0.0140 Диаметр опухоли, см < 1 1,00 1-4 1,78 0,39-8,10 0,4587 > 4 6,20 1,13-33,92 0,0352 Пол: женский 1,00 мужской 2,62 0,91-7,55 0,0741 15% случаев происходит развитие гематогенного метастазирования при данном типе рака [2]. Мы показали, что отрицательное/низкое выражение экспрессии Met/HGF-R является наиболее эффек тивным показателем гематогенного метастазирова ния. Met/HGF-R не связан с другими характери стиками опухоли, включая ее гистологический ва риант, размер, экстратиреоидное распространение и метастазирование в лимфатические узлы. Результаты проведенного нами исследования Met/HGF-R были сопоставимы с определением Met/HGF-R с помощью количественных методов [9]. Однако иммуногистохимический метод, несо мненно, нуждается в адекватной стандартизации при использовании его в различных лабораториях. Таблица 5 Многовариантный анализ пациентов с папиллярным раком щи товидной железы в соответствии с клиническими и патологиче скими параметрами и выражением экспрессии Met/HGF-R Критерий Отдаленное метастазирова ние коэффи циент опасно сти интервал 95% дове рительно сти Р Met/HGF-R: ВЫСОКИЙ 1,00 негативный/низкий 9,71 2,10-44,900,0036 Сосудистая инвазия: нет 1,00 да 3,19 1,08-9,46 0,0358 Экстратиреоидное распространение: нет 1,00 да 4,25 1,28-14,110,0181 Возраст, годы: < 45 1,00 > 45 3,99 1,39-11,45 0,0099 Поскольку выражение экспрессии Met/HGF-R может измеряться не только в срезах ткани, но и в цитологических пунктатах, она может стать полез ным маркером для выбора тактики лечения и на блюдения за больными раком щитовидной железы. Полученные результаты соотносятся и с имеющей ся в литературе информацией относительно Met/ HGF-R. Так, имеются данные о том, что отрица тельная экспрессия Met/HGF-R связана со значи тельно более коротким выживанием больных ра ком поджелудочной железы и раком молочной же лезы по сравнению с теми пациентами, у которых выявлена его высокая экспрессия [3, 5]. Биологи ческая взаимосвязь между отрицательной/низкой экспрессией Met/HGF-R и отдаленным метастази рованием при папиллярном раке щитовидной же лезы не является неожиданной, принимая во вни мание тот факт, что фактор роста гепатоцитов - HGF - стимулирует рост клетки, ее подвижность, проницаемость клеточной мембраны и ряд других морфогенетических процессов типа ангиогенеза [8]. На некоторых линиях раковых клеток, если они дифференцированы, HGF стимулирует морфоге нетическую реакцию, которая является тканьопос- редованной и наследственно закрепляется. Хоро- шо-дифференцированные раковые клетки щито видной железы с высокой экспрессией Met/HGF-R отвечают на влияния HGF изменениями в поляри зации мембран [10]. Поскольку Met/HGF-R выра жен почти в 70% папиллярных карцином, это и яв ляется самым начальным этапом в процессе по этапного канцерогенеза. Снижение же экспрессии Met/HGF-R может указывать на развитие более аг рессивной в метастатическом плане опухоли. Выводы 1. Гиперэкспрессия Met/HGF-R - это раннее явление в тиреоидном канцерогенезе, наиболее ха рактерное для папиллярного типа рака. 2. В папиллярном раке щитовидной железы от- рицательная/низкая экспрессия Met/HGF-R слу жит наиболее важным показателем высокой веро ятности гематогенного метастазирования опухоли. Данный маркер может широко использоваться в клинической практике.