Аутоантитела к глутаматдекарбоксилазе у детей с впервые выявленным инсулинзависимым сахарным диабетом

Инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД) занимает существенное место в структуре хронической патологии детей и подростков. Современные данные свидетельствуют об аутоиммунной природе деструкции р-клеток поджелудочной железы, что приводит к манифестации сахарного диабета (СД) I типа. Большое значение имеют исследования, направленные на изучение патогенетических механизмов развития этого заболевания, выявление антигена-мишени для аутоиммунного процесса. В настоящее время основной мишенью для аутоантител (АТ) к островковым клеткам поджелудочной железы считается антиген (АГ) Р-64 [1, 2, 11]. АТ к АГ Р-64 впервые были обнаружены у больных ИЗСД в 1982 г. S. Baekkeskov. Р-64 представляет собой белковый комплекс, состоящий из субъединиц с мол. м. 64—69 кДа. Этот АГ видонеспецифичен, обнаруживается как на поверхности р-клеток, так и в цитоплазматической области [1, 2]. Роль АТ к АГ Р-64 в патогенезе заболевания и высокая специфичность этого иммунологического маркера для развития ИЗСД подтверждаются как при изучении СД I типа на лабораторных животных- мышах линии NOD и крысах линии ВВ [9], так и в клинических исследованиях [4—6, 9—11]. Данные АТ определяются в крови за несколько месяцев или даже лет до клинической манифестации СД, встречаются у 80—90 % больных с впервые выявленным ИЗСД и отсутствуют у здоровых лиц [10]. В последнее время выяснено, что данный комплекс, будучи одной из регуляторных структур р-клетки, модулирует стимулируемую глюкозой секрецию инсулина [1, 10]. АГ Р-64 имеет ферментативную активность декарбоксилазы глутаминовой кислоты (ГДК), катализирующей синтез гаммааминомасляной кислоты (ГАМК). В свою очередь ГАМК является одним из основных медиаторов нейроэндокринной системы [1, 6, 10]. В максимальном количестве ГДК содержится как в островковых клетках поджелудочной железы (островковая форма), так и в клетках Пуркинье мозжечка (мозговая форма) [3, 7, 8]. Очень высокая степень гомологии обеих форм показана при изучении их на молекулярном уровне. Установлено, что аутоантитела к островковой ГДК идентичны аутоантителам к АГ Р-64 и имеется перекрестное взаимодействие меж-

Микрофотография клеток Пуркинье мозжечка. Специфическое иммунофлюоресцентное окрашивание клеток Пуркинье на срезе мозжечка крысы при наличии антител к ГДК в тестируемой сыворотке крови. Х450.

ду АТ к АГ Р-64 и мозговой ГДК [1, 12]. Обнаружение АТ к мозговой ГДК в сыворотке крови больных ИЗСД является еще одним подтверждением схожести мозговой и островковой форм ГДК и позволяет рассматривать аутоантитела к мозговой ГДК как иммунологический маркер ИЗСД. Известно, что СД I типа обладает значительным полиморфизмом как по характеру манифестации, так и по течению заболевания. На развитие СД в детском возрасте могут оказывать влияние половые и возрастные особенности, наличие наследственной предрасположенности и т. д. Для изучения подобных вопросов патогенеза ИЗСД детского возраста несомненный интерес представляет исследование маркеров аутоиммунитета у больных СД детей в сравнении с их здоровыми сверстниками.

Цель настоящего исследования — выявить частоту встречаемости аутоантител к мозговой ГДК у детей с впервые выявленным ИЗСД, а также установить возможную зависимость встречаемости этого маркера от пола, возраста обследуемых, наличия ИЗСД у ближайших родственников ребенка, возникновения ацетонурии в момент манифестации, быстроты развития клинической картины заболевания.

Материалы и методы

Аутоантитела к мозговой форме ГДК определяли в крови у 48 детей 1—14 лет, в том числе у 36 с впервые выявленным ИЗСД, у 2 с нарушенной толерантностью к глюкозе (НТГ), у 10 практически здоровых (контрольная группа). Диагноз установлен в соответствии с классификацией ВОЗ. Дети, больные ИЗСД, обследованы в сроки от 1 года до 12 дней от начала инсулинотерапии. Все обследуемые были разделены на группы по полу и возрасту, дети с ИЗСД — дополнительно по следующим признакам: семейный (болен один из близких родственников ребенка и более) или спорадический характер заболевания, длительность продромального периода (время от первых клинических признаков до явного проявления инсулиновой недостаточности), наличие или отсутствие ацетонурии. Среди обследованных детей было II мальчиков и 22 девочки с СД и 2 девочки с НТГ. По возрасту все дети были разделены на 3 группы: 1—4 года (младшая), 5—9 лет (средняя), 10—14 лет (старшая). В младшей возрастной группе оказалось 6 (16,7%) детей, больных СД I типа, мальчиков и девочек поровну. В средней группе было 12 (33,3%) детей (2 мальчика, 10 девочек), больных СД, в старшей — 18 (50%) детей (8 мальчиков и 10 девочек). Девочки с НТГ относились к средней возрастной группе. В контрольной группе 2 детей были в возрасте 5—9 лет, 8 — в возрасте 10—14 лет. Семейный анамнез заболевания выявлен у 6 (15,8%) детей. Длительность продромального периода составила в среднем 4,5± 1,8 нед. Минимальной (2± ±0,6 нед) она была у детей 1—4 лет, максимальной (6,3± ±3,8 нед) — у детей 10—14 лет. У 2 мальчиков 11 и 13 лет и девочки 9 лет она превысила 20 нед. Ацетонурия встречалась у 60 % детей.

Для определения аутоантител к мозговой форме ГДК в сыворотке крови людей был разработан вариант реакции непрямой иммунофлюоресценции на криосрезах мозжечка крыс линии Вистар. Ткани замораживались в жидком азоте. С помощью криотома LEITZ приготовлялись криосрезы толщиной 4 мкм с последующей фиксацией в ацетоне при 4 °C. Срезы служили в качестве антигена для тестирования исследуемых сывороток на присутствие специфических аутоантител. Участки неспецифического связывания блокировались нормальной кроличьей сывороткой. Исследуемые сыворотки разводились в соотношении 1:10 в фосфатно-буферной смеси с добавлением 20 % телячьей эмбриональной сыворотки, предварительно инактивированной при 56 °C в течение 30 мин.

Аутоантитела из сыворотки кр,ови больного, связавшиеся с участками среза ткани, содержащими АГ, выявлялись вторичными АТ, конъюгированными с флюоресцинизотиоцианатом (ФИТЦ). В реакции использовали конъюгат кроличьей сыворотки против иммуноглобулинов человека (RAH) с ФИТЦ, разведенный в фосфатном буфере в соотношении 1:150 с добавлением бычьего сывороточного альбумина. Учет реакции производился с помощью флюоресцентного микроскопа с фотоприставкой. Специфическое окрашивание среза, обработанного сывороткой больного, свидетельствовало о наличии специфических аутоантител у данного больного (см. рисунок).

В качестве отрицательного контроля реакции использовалась сыворотка крови здорового донора, не содержащая аутоантитела, положительного — АТ-позитивная сыворотка крови больной ИЗСД 24 лет. Контрольные сыворотки предварительно были тестированы на наличие аутоантител к ГДК методом радиоиммунопреципитации глутаматдекарбоксилазной активности в лизате мозжечка.

Обработка полученных данных производилась на основе использования методов математической статистики. Основными показателями являлись среднее значение статистического ряда, среднеквадратическое отклонение, коэффициент вариации изучаемых показателей, ошибка средней, ошибка разности. Принималось Р±95%, /=2 как для абсолютных, так и для относительных единиц измерения. При сравнении групп детей по разным признакам с учетом возраста и пола применялся метод стандартизации.

Результаты и их обсуждение

Из 36 детей с впервые выявленным СД I типа аутоантитела к мозговой форме ГДК присутствовали у 30 (83,3±12,4 %) (Р=95%). Также наличие АТ выявлено у 1 девочки с НТГ. Все дети из контрольной группы были антителонегативными (АТ^-).

Полученные результаты подтверждают частую выявляемость АТ к мозговой ГДК у детей с впервые выявленным ИЗСД, сходную с частотой обнаружения АТ к АГ Р-64 у больных СД I типа. Основой этого являются упомянутые ранее высокая корреляция между данными видами антител, а также структурная гомология мозговой ГДК и АГ Р-64 островковых клеток поджелудочной железы. Так, по сообщениям I. Dedov и соавт.

• , W. Riley [9], АТ к Р-64 присутствовали у 89 и 86,9 % больных ИЗСД, а АГ к мозговой ГДК — более чем у 80 % больных вновь выявленным ИЗСД. По данным Drash и соавт.
• , АТ к АГ Р-64 обнаруживаются у 73 % детей с СД I типа. Все авторы указывают на отсутствие этого маркера в контрольной группе, что свидетельствует о высокой специфичности данного иммунологического маркера для ИЗСД. Многие авторы [1, 4, 10, И] считают аутоантитела к ГДК более специфичными для ИЗСД, чем другие виды аутоантител (общие аутоантитела к цитоплазматическим и поверхностным структурам р-клеток).

Вопрос обнаружения аутоантител у детей с НТГ требует дальнейшего изучения. В нашем случае у антителопозитивной (АТ⁺) больной с НТГ вероятно развитие ИЗСД, особенно учитывая семейный анамнез. Однако возможен транзиторный вариант присутствия аутоантител без дальнейшего развития СД I типа.

Результаты сравнительного изучения частоты АТ⁺-случаев в различных группах детей приведены ниже. Антителопозитивными оказались 83 % больных ИЗСД детей младшей возрастной группы, 100 % — средней и 72 % — старшей. Различие между младшей и средней группами статистически недостоверно. При сравнении же детей 1—9 и 10—14 лет выявилось явное преобладание (/=2, Р=95 %) АТ⁺-больных в 1-й группе. Соотношение девочек и мальчиков, имеющих аутоантитела, во всех возрастных группах было 1:1. У 100% детей с семейным анамнезом ИЗСД найдены АТ к ГДК. Среди детей со спорадическим ИЗСД АТ выявлены у 78,6 %. Различия по этому показателю для обеих групп имеют высокую степень достоверности. У ребенка с НТГ, имеющего аутоантитела, среди родственников двое страдают СД I типа. По характеру дебюта заболевания (наличие ацетонурии, длительность продромального периода) существенных различий между АТ⁺- и АТ^_- детьми не найдено. Однако обращает на себя внимание относительно более редкое развитие ацетонурии у АТ^_-детей.

Более высокая частота АТ⁺-детей в группе детей 1—9 лет по сравнению с группой 10—14 лет может свидетельствовать о некотором различии в патогенезе ИЗСД и особенностях аутоиммунного процесса у детей до- и пубертатного возраста. Уменьшение выявляемое™ аутоантител при увеличении возраста начала СД было отмечено и при изучении антиостровковых цитоплазматических аутоантител [11].

Половых различий при анализе данного звена аутоиммунитета у детей не найдено. Однако другой фактор — наследственность, по-видимому, играет роль. На это указывает достоверное различие в выявляемости АТ у детей с семейным и спорадическим ИЗСД. После стандартизации по возрасту и наличию семейного СД у детей разных возрастных групп отличие по этим показателям сохранялось. Это указывает на независимое влияние наследственности и более раннего возраста начала СД на появление аутоантител.

В настоящем исследовании взаимосвязи длительности продромального периода, тяжести манифестации заболевания и признаков аутоиммунного процесса не найдено. Однако эта проблема требует дальнейшего изучения. Возможно, на длительность продромального периода и тяжесть обменных нарушений в дебюте ИЗСД в большей степени влияют провоцирующие факторы окружающей среды и своевременность начала ин- сулинотерапии.

Выводы

1. Наличие аутоантител к мозговой ГДК в сыворотке крови детей является маркером ИЗСД и обнаруживается у 83,3 % детей с впервые выявленным ИЗСД.
2. Сравнительное изучение частоты АТ⁺-слу- чаев в различных возрастных группах детей, больных ИЗСД, показало, что аутоантитела к ГДК чаще присутствуют у детей, заболевших в возрасте 1—9 лет.

Выявляемое™ АТ у детей с семейным анамнезом ИЗСД значительно выше по сравнению с детьми, имеющими спорадический ИЗСД.