Активность неспецифической эстеразы и α-глицерофосфатдегидрогеназы в лимфоцитах крови у больных аутоиммунным тиреоидитом

Аутоиммунный тиреоидит (АИТ) - широко распространенная патология щитовидной железы, при которой нарушения в иммунной системе явля  ются и этиологическим фактором, и обусловлива  ют основные патогенетические процессы [3, 13]. Иммунокомпетентные клетки, синтезируя биоло  гически активные вещества, а также через аутоим  мунные реакции, оказывают значимое влияние на гомеостаз организма. В то же время богатый набор рецепторов делает их высокочувствительными к разнообразным изменениям во внутренней среде организма [14]. В последние годы значительное развитие получило новое направление исследова  ний, позволяющее одновременно оценить степень нарушения гомеостаза в организме и уровень функциональных возможностей иммунокомпе  тентных клеток, - изучение метаболических пара  метров лимфоцитов в норме и при патологии [1,5]. Именно на уровне метаболической системы клеток происходит реализация регуляторных воздействий и формируются ответные реакции.

Целью исследования явилось изучение взаимо  связей между уровнями активности неспецифиче  ской эстеразы (НЭ) и а-глицерофосфатдегидроге- назы (а-ГФДГ) лимфоцитов и концентрацией ти  реотропина, тиреоидных гормонов и кортизола в крови у лиц с АИТ.

Выбор данных метаболических параметров обу  словлен тем, что представленные ферменты опре  деляют функциональную возможность иммуно  компетентных клеток, а синтез а-ГФДГ в клетках регулируется тиреоидными гормонами [9, 11].

Материалы и методы

Обследованы женщины в возрасте 20-50 лет: 37 больных с впервые выявленным АИТ в состоянии эутиреоза и 15 практически здоровых женщин. Ди  агноз АИТ ставили на основании клинических данных, результатов ультрасонографии щитовид  ной железы и по оценке титра антител к тиреоид  ной пероксидазе. Проводили цитологический ана  лиз биопсийного материала щитовидной железы и радиоиммунный анализ концентрации тиреотроп  ного гормона (ТТГ), тиреоидных гормонов (Т₃, Т₄ и FT₄) и кортизола.

Цитохимическое окрашивание лимфоцитов пе  риферической крови на а-ГФДГ осуществляли по методу Р. П. Нарциссова [4]. В качестве субстрата для цитохимической реакции на НЭ использовали а-нафтилбутират |8]. Для оценки активности а- ГФДГ и НЭ применяли метод компьютерной мор- фоденситометрии [2, 12]. Измерения осуществляли на цитоморфоденситометрической установке "ДиаМорф". Изображение представляется с микро  скопа Люмам (объектив 100, оптовар 2,5) в микро  ЭВМ в виде первичной матрицы распределения интенсивностей. Матрица имеет размерность 256 х 256 элементов (пиксель). Каждый элемент матрицы представляет собой усредненную на пло  щади 1 пиксель величину интенсивности. При этом интенсивность каждого ее элемента лежит в пределах от 0 до 255, т. е. всего 256 градаций полу  тонов серого при квантовании по интенсивности от 0 - черное до 255 - белое (байт на точку). В ре  зультате цитохимическое изображение характери  зуется оптическими и геометрическими признака  ми: S - площадь гранул (пиксель²), Р - суммар  ный периметр гранул (пиксель), FF - фактор фор  мы (где 1 - абсолютная окружность), OD - сред  няя оптическая плотность (в единицах оптической плотности - е. о. п.), Их - усредненное (на 1 клет  ку) значение расстояния между гранулами по оси X (пиксель), Ry - усредненное (на 1 клетку) значе  ние расстояния между гранулами по оси Y (пик  сель), IOD - интегральная оптическая плотность (пиксель х е. о. п.).

Для всех полученных данных определяли сред  нее арифметической значение (X) и ошибку сред  ней арифметической (т). Проверку гипотезы о ста  тистической достоверности отличий двух выборок проводили с помощью критерия Манна-Уитни. Уровни взаимосвязи между активностью внутри  клеточных ферментов и концентрацией гормонов оценивали с помощью корреляционного анализа.

Результаты и их обсуждение

Морфоденситометрические параметры а-ГФДГ лимфоцитов крови здоровых людей и больных АИТ представлены в табл. 1. Обнаружено, что у больных женщин в лимфоцитах крови значительно возрастает оптическая плотность гранул диформа- зана, образованного в ходе ферментативной реак  ции а-ГФДГ. Исследуемый фермент локализуется строго в митохондриальном компартменте и явля  ется компонентом а-глицерофосфатного водород  ного шунта, регулирующего соотношение НАДН/ НАД⁺ в цитоплазме и митохондриях [10]. Увеличе  ние оптической плотности при отсутствии измене  ний площади и периметра позволяет предположить активацию а-ГФДГ и отсутствие повышенного синтеза фермента. Кроме того, отсутствие увеличе  ния площади, периметра и усредненного расстоя  ния между гранулами диформазана (образованного в результате ферментативной реакции) в лимфоци  тах у больных АИТ позволяет также предположить, что площадь митохондрий в иммунокомпетентных клетках при данной патологии не изменяется.

До сих пор обсуждается возможность использо  вания ферментативной реакции с а-нафтилбутира- том (НЭ) для дифференциации морфологических вариантов лимфоцитов [6, 8, 11]. Предполагается, что лимфоциты с отрицательной реакцией на НЭ являются В-лимфоцитами, лимфоциты с локаль  ным распределением активности НЭ (в виде 1-2 крупных гранул) - Т-хелперами, а клетки с диф  фузным распределением активности фермента - оставшимися субпопуляциями Т-клеточной систе  мы (см. рисунок). Нами обнаружено, что у паци  ентов с АИТ достоверно повышено относительное содержание лимфоцитов с локальным распределе  нием активности НЭ (10,83 ± 2,69% у здоровых, 25,58 ± 3,55% у больных АИТ; р < 0,05), но сниже  на концентрация иммунокомпетентных клеток с

Таблица 1

Морфоденситометрические параметры активности а-ГФДГ в лимфоцитах крови здоровых людей и больных АИТ (X ± т)

IOD, (пиксель-е. о. п.) 982,23 ± 211,67 1278,04 ± 161,38                  -

а

Лимфоциты с локальным (а) и диффузным (б) распределением активности НЭ.

отрицательной реакцией на НЭ (здоровые - 51,27 ± 3,47%, АИТ - 23,74 ± 3,90%; р < 0,01).

При данной патологии изменяются и морфо  денситометрические параметры НЭ в лимфоцитах крови (табл. 2), причем все выявленные изменения в морфоденситометрических параметрах НЭ лим  фоцитов крови женщин с АИТ по сравнению со здоровыми однозначно отражают выраженную ак  тивацию фермента. Так, в лимфоцитах с диффуз  ным распределением НЭ выявляется увеличение площади, периметра, оптической плотности и как следствие интегральной оптической плотности НЭ. Снижение фактора формы при АИТ опреде  ляется большим количеством раздельных гранул, в то время как в лимфоцитах здоровых женщин чаще встречаются конгломераты гранул. По этой же причину в лимфоцитах больных АИТ повышено усредненное расстояние между гранулами. Грану  лы, представляющие собой продукт ферментатив  ной реакции НЭ в иммуноцитах лиц с АИТ, рас  пределены по всей клетке.

Выявлены различия в величинах морфоденсито  метрических параметров НЭ в лимфоцитах с ло  кальным распределением активности. В данной популяции клеток у пациентов с АИТ обнаружено увеличение площади, периметра, оптической плот  ности и интегральной оптической плотности цито  химических гранул.

При исследовании связей между уровнями ис  следуемых гормонов и величинами морфоденсито  метрических показателей активности а-ГФДГ и НЭ в лимфоцитах крови обнаружено различие взаимоотношений в системе корреляционных свя  зей здоровых женщин и больных АИТ. У здоровых женщин выявляется положительная взаимосвязь Т₄ и FT₄ с усредненным расстоянием между гранула  ми диффузно распределенной НЭ в лимфоцитах крови (г = 0,50; 0,1 > р > 0,05 и г = 0,78; р < 0,05 соответственно). Также обнаружены положитель  ные корреляционные связи FT₄ с площадью, пери  метром и интегральной оптической плотностью гранул диффузно распределенной НЭ (г = 0,80, р < 0,01; г = 0,80, р < 0,01 и г = 0,59, р < 0,05 соот  ветственно). Для этой же группы установлены от  рицательные взаимосвязи ТТГ с оптической плот  ностью локально и диффузно распределенных гра  нул НЭ в клетках (г = -59 и г = -0,63; р < 0,05 со  ответственно), а также положительные корреляци  онные связи ТТГ с усредненным расстоянием ме  ждулокально и диффузно распределенными грану  лами НЭ (г = 0,63 и г = 0,56; р < 0,05 соответствен  но). Можно сделать заключение о том, что тирео  идные гормоны в целом активируют НЭ, причем увеличение активности НЭ сопровождается рас  пределением гранул по всей лимфоидной клетке. В связи с этим не удивительно, что выявляется отри  цательная взаимосвязь концентрации ТТГ с актив  ностью НЭ в лимфоцитах крови.

Таблица 2

Морфоденситометрические параметры НЭ в лимфоцитах крови

В лимфоцитах с локальным распределением активности

У больных АИТ обнаружены отрицательные связи между концентрацией Т₃, Т₄ и показателями усредненных расстояний между диффузно распре  деленными гранулами НЭ в лимфоцитах (г= -0,31 и г= -0,31; 0,1 > р> 0,05 соответственно). Кроме того, у лиц данной группы выявляется также поло  жительная корреляция между Т₄ и оптической плотностью диффузно распределенной НЭ в клет  ках (г = 0,33; 0,1 > р > 0,05). В целом можно отме  тить, что взаимосвязи между тиреоидными гормо  нами и активностью НЭ в лимфоцитах крови у больных АИТ ослабевают. Однако, как и у здоро  вых лиц, у больных АИТ проявляется тенденция к активирующему действию тиреоидных гормонов на уровень НЭ в иммунокомпетентных клетках. В лимфоцитах здоровых лиц повышение концентра  ции тиреоидных гормонов сопровождается более диффузным распределением гранул по клетке, в то время как у больных с АИТ гранулы располагаются конгломератами. Достоверных связей между кон  центрацией ТТГ в сыворотке и морфоденситомет- рическими параметрами НЭ в лимфоцитах боль  ных АИТ не найдено.

Характер обнаруженных взаимосвязей между концентрациями тиреоидных гормонов и морфо- денситометрическими показателями а-ГФДГ в лимфоцитах здоровых и больных лиц противопо  ложен. Так, в группе здоровых установлены поло  жительные корреляционные связи содержания Т₃ и FT₄ с усредненным расстоянием между гранулами а-ГФДГ (г = 0,84 и г - 0,59; р < 0,05 соответствен  но), а также между концентрацией Т₄ и площадью гранул (г = 0,81; р < 0,05). Кроме того, в данной группе обследуемых обнаружена отрицательная взаимосвязь между концентрацией ТТГ и оптиче  ской плотностью гранул диформазана (/-=-0,91; р < 0,05), образованного в результате реакции а-ГФДГ. В то же время у женщин с АИТ выявлены отрица  тельные взаимосвязи площади гранул диформазана с уровнем Т₃, Т₄ и FT₄ в сыворотке (г = -0,34, 0,1 >/>>0,05;                    г=-0,31, р < 0,05;                   г=-0,38,

0,1 > р > 0,05 соответственно), а также концентра  ции Т₄, FT₄ с периметром гранул продукта реакции (г = -0,36 и г= -0,34; 0,1 > р > 0,05 соответствен  но). Однако при патологии установлены также по  ложительные взаимосвязи концентрации Т₃, Т₄ с фактором формы (г =0,39, р < 0,05 и г =-0,36, 0,1 > р > 0,05 соответственно).

Известно, что тиреоидные гормоны индуцируют синтез а-ГФДГ в клетках [9, 11]. В связи с этим ста  новится понятной выявленная положительная взаимосвязь активности а-ГФДГ в лимфоцитах у здоровых женщин с концентрацией тиреоидных гормонов и отрицательная - с уровнем ТТГ. У больных женщин обнаружена инверсия взаимосвя  зи тиреоидных гормонов с активностью данного фермента. Следовательно, наличие аутоиммунного процесса в организме не изменяет "точек приложе  ния" метаболического действия гормонов, но трансформирует направленность регуляции.

При обследовании группы здоровых женщин обнаружены также корреляционные связи между концентрацией кортизола в сыворотке крови и морфоденситометрическими показателями НЭ в лимфоцитах. При этом выявлена взаимосвязь с НЭ как с локально распределенными гранулами (с площадью, периметром, усредненным расстояни  ем между гранулами: г =0,78, г =0,74, г =0,87; р < 0,01, с интегральной оптической плотностью гранул: г = 0,72, р < 0,05 соответственно), так и с диффузно распределенными (с оптической плот  ностью и интегральной оптической плотностью: г = 0,63 и г = 0,66; р < 0,05 соответственно). НЭ является катаболическим ферментом [7, 15]. Уста  новленные положительные взаимосвязи морфо- денситометрических параметров НЭ в лимфоцитах крови и концентрации кортизола позволяют пред  положить четкую регуляцию активности фермента данным гормоном, который, как известно, индуци  рует катаболические процессы в иммунокомпе  тентных клетках [6]. Необходимо подчеркнуть, что не найдено достоверных взаимосвязей между кон  центрацией кортизола и морфоденситометриче  скими показателями исследуемых внутриклеточ  ных ферментов у больных АИТ.

Таким образом, морфоденситометрический анализ активности а-ГФДГ и НЭ в лимфоцитах крови здоровых женщин и больных АИТ позволил выявить различия, определяющие метаболические особенности иммунокомпетентных клеток. При АИТ установлено локальное повышение активно  сти а-ГФДГ в лимфоцитах, проявляющееся в виде повышения оптической плотности гранул. По  скольку при этом отсутствует повышение площади гранул диформазана, можно сделать заключение о том, что активация фермента происходит не за счет его синтеза. Морфоденситометрический анализ также позволил обнаружить увеличение активно  сти НЭ, что отражает повышение деструктивных реакций в иммунокомпетентных клетках при ис  следуемом аутоиммунном процессе. Кроме того, у лиц с АИТ выявлены регуляторные изменения влияния тиреоидных гормонов, ТТГ, кортизола на активность НЭ и а-ГФДГ в лимфоцитах.

Выводы

1. В лимфоцитах крови у больных АИТ установ лены выраженное увеличение уровня НЭ и локаль  ная активация а-ГФДГ при отсутствии повышен  ного синтеза фермента.
2. У больных АИТ слабее взаимосвязи между концентрацией гормонов и морфоденситометриче скими параметрами НЭ и а-ГФДГ в лимфоцитах.
3. Направленность регуляции активности НЭ тиреоидными гормонами в лимфоцитах крови здо ровых и лиц с АИТ совпадает. В то же время регу  лирующее воздействие тиреоидных гормонов на а-ГФДГ у больных АИТ противоположно анало  гичному действию у здоровых.