Роль антигипофизарных антител в патогенезе гиперпролактинемии

Как показали исследования последних лет, аутоиммунные нарушения являются пусковым механизмом в развитии сахарного диабета типа 1, аутоиммунного тиреоидита, диффузного токсического зоба и многих других заболеваний периферических эндокринных желез [2, 8]. Изучение показателй гуморального иммунитета у больных с различными нейроэндокринными заболеваниями позволяет утверждать, что аутоиммунные нарушения могут также играть определенную роль в формировании гипофизарных расстройств, и маркерами таких нарушений считают антитела к поверхностным антигенам клеток аденогипофиза - АПАГ [5, И]. АПАГ обнаруживаются при некоторых формах гипопитуитаризма [13], изолированной СТГ-недостаточ- ности [4], синдроме "пустого" турецкого седла [9] и других гипофизарных заболеваниях. Одним из наиболее распространенных нейроэндокринных расстройств является гиперпролактинемия. Причины патологического повышения уровня пролактина (Прл) многочисленны [1]. Часто выявляется Прл-секретирующая опухоль гипофиза, однако в значительном числе случаев существенное повышение уровня Прл отмечаетсчя в отсутствие аденомы гипофиза и каких-либо видимых Прл-стимулирующих воздействий - так называемая идиопатическая гиперпролактинемия. С целью оценки возможной роли аутоиммунных нарушений в патогенезе гиперпролактинемии в настоящей работе изучались показатели гуморального иммунитета - антитела к поверхностным антигенам клеток аденогипофиза и антитела к Прл - у пациенток с гиперпролактинемией опухолевого и неопухолевого происхождения. Материалы и методы Обследовано 70 женщин от 19 до 46 лет, из них 26 с идиопатической гиперпролактинемией (1-я группа), 32 с секретирующими аденомами гипофиза (2-я группа), а также 12 беременных с физиологической гиперпролактинемией (3-я группа). Основными клиническими проявлениями заболевания у пациенток с патологической гиперпролактинемией были отсутствие менструаций или нарушение менструального цикла по типу олиго/опсоме- нореи, галакторея, бесплодие, головные боли. Состояние области турецкого седла у всех больных оценивалось с помощью рентгеновской компьютерной томографии с использованием аппарата "Somaton" ("Somaton", ФРГ) и/или магнитно-резонансной томографии на аппарате BNT-1000 ("Bruker", ФРГ). Размер аденомы гипофиза у больных 2-й группы варьировал от 8 до 14 мм. У всех женщин исследовали содержание иммунореактивного Прл в сыворотке крови, у женщин 1-й и 2-й групп - содержание тиреотропного, лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов. У женщин с сохранным менструальным циклом определение Прл и гонадотропинов проводили на 5-7-й день менструального цикла. Содержание Прл в сыворотке крови определяли с помощью реагентов, поставляемых ВОЗ либо полученных в лаборатории молекулярной эндокринологии ЭНЦ РАМН и откалиброванных по соответствующей тест-системе ВОЗ. Уровень общего иммунореактивного Прл в сыворотке крови варьировал от 741 до 3200 мЕ/л в 1-й группе, от 1519 до 17 000 мЕ/л во 2-й и от 3690 до 6800 мЕ/л в 3-й. Определение АПАГ в сыворотке крови осуществляли твердофазным иммуноферментным методом [2, 3]. Первичную суспензию клеток аденогипофиза крысы или пролактиномы человека в количестве 40 000-50 000 клеток на лунку иммобилизовали на плоскодонных 96-луночных планшетах "Nunc", предварительно обработанных 0,01% раствором лизина. Клетки фиксировали глутаровым альдегидом, нейтрализовали глицином и свободные места в лунках блокировали 2% бычьим сывороточным альбумином. Тестируемую сыворотку разводили в соотношении 1:100 в фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl, и в количестве 0,1 мл вносили в лунку и далее проводили анализ методом, описанным ранее [3]. Окраску измеряли на медицинском фотометре "Эфос" при 492 нм. В качестве внутреннего стандарта в каждом опыте использовали 2 контрольные позитивные сыворотки и 10 контрольных негативных сывороток (лабораторные стандарты). Тестируемя сыворотка считалась положительной - АПАГ (+), если величина ее оптической плотности (D492) была выше М ± Зег, где М - средняя величина оптической плотности контрольных негативных сывороток. Если D492 тестируемой сыворотки была ниже М ± За, но выше М ± 2а, то сыворотка считалась слабоположительной - АПАГ(±). Коэффициент вариации внутри одного опыта составлял 12,8%, между опытами - 14,5%. Наличие в сыворотке крови антител к Прл оценивали по способности иммуноглобулиновой фракции сыворотки связывать высокоочищенный Прл, меченный радиоактивным йодом. Высокоочищенный Прл человека йодировали с помощью йодогена. Связывание [|251]-Прл иммуноглобулинами в сыворотке крови определяли методом, основанным на осаждении иммунных комплексов 12,5% полиэтиленгликолем-6000 (ПЭГ-6000) [6]. Реакционная смесь для анализа связывания меченого Прл в сыворотке крови состояла из 50 мкл 0,05 М натрий-фосфатного буфера с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,01% мертиолата (буфер инкубации), 50 мкл сыворотки крови и 15-20 тыс. имп/мин [1251]-Прл в 50 мкл буфера инкубации. Пробы инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С. По окончании инкубации к реакционной смеси добавляли 150 мкл 25% ПЭГ-600,0 пробы тщательно перемешивали, выдерживали 15 мин при температуре 4°С и центрифугировали 30 мин со скоростью 3000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок взмучивали в 150 мкл буфера инкубации и переосаждали равным объемом 25% ПЭГ-6000. Радиоактивность осадков после промывания измеряли на гамма- спектрометре. О связывании меченого Прл судили по доле радиоактивности в материале, осевшем в этих условиях, в процентах от общего количества добавленной метки. Прл-связывающая способность сыворотки крови считалась повышенной, если процент [1251]-Прл, осаждавшегося в присутствии ПЭГ, составлял М ± 2а, где М - средняя ве- личина Прл-связывающей способности контрольных сывороток крови. Достоверность различия частот выявления антител в обследованных группах оценивали по критерию х2. Результаты и их обсуждение Пациентки с наличием АПАГ в сыворотке крови были выявлены в обеих группах больных с патологической гиперпролактинемией (см. рисунок). При использовании клеток аденогипофиза крыс в качестве антигеноносителей в 1-й группе АПАГ были обнаружены у 10 (38,5%) пациенток, во 2-й - у 6 (18,7%) и в 3-й не найдены ни у одной. Несмотря на то что наличие АПАГ было найдено у большего числа больных с идиопатической гиперпролактинемией по сравнению с пролактиномами, преобладание АПАГ-положительных больных в 1- й группе по сравнению со 2-й было статистически недостоверным. В исследованиях, проведенных с использованием клеток пролактиномы человека в качестве антигеноносителей, АПАГ определялись у 20 (76,9%) больных 1-й группы и у 9 (29%) 2-й группы, у лиц 3-й группы АПАГ не обнаружены. Было отмечено достоверное (р < 0,001) преобладание АПАГ-позитив- ных пациенток в 1-й группе по сравнению со 2-й. Ранее проведенные исследования продемонстрировали возможность использования клеток аденогипофизов крыс для скринингового определения АПАГ [2, 5, 11]. В нашем исследовании у 8 из 10 пациенток 1-й группы и у 5 из 6 больных группы, у которых определялись АПАГ на клетках аденогипофиза крыс, выявлялись антигипофизарные ан- Наличие АПАГ в сыворотках крови пациентов с гиперпролак- тинемией различного генеза при использовании клеток аденогипофиза крыс (а) и клеток пролактиномы человека (б). ▲ ▲ ▲ А А А 1 1 ► ► ► 1 А А А А А А А А ▲ ▲ А А А А А А А А А i А А А А А А ▲ ▲ А А А А А А А А 1 А А А 1 А А А А А А 1 А 6 А А ▲ ▲ ▲ А А А i А А А А А А А А А А 1 ▲ А А А за А ▲ А А А А А А А А А А А А А А А А А А А А А А А А А А А 1 1 - идиопатическая гиперпролактинемия (п = 26); 2 - пролактиномы (л = 32); 3- физиологическая гиперпролактинемия (л = 12). По оси ординат - оптическая плотность О4У2. титела и на клетках пролактиномы человека. Однако использование клеток пролактиномы позволило выявить наличие антигипофизарных антител в большем количестве случаев. При сравнении частоты выявления АПАГ на различных антигеноно- сителях оказалось, что для опухолевой гиперпролактинемии эта разница статистически незначима, в то время как при идиопатической гиперпролактинемии АПАГ обнаруживались достоверно чаще (/? = 0,011) при использовании лактотрофов по сравнению с клетками аденогипофиза крыс. В популяции Российской Федерации АПАГ могут обнаруживаться до 4,5% случаев среди лиц без эндокринных заболеваний [2]. При различных эндокринных заболеваниях частота выявления АПАГ значительно возрастает - от 16,6% при синдроме Шмидта до 44,4% при инсулиннезависимом сахарном диабете [2, 4, 9]. Мы не обнаружили АПАГ у обследованных женщин с физиологическим повышением уровня Прл во время беременности, однако выявили антигипофизарные антитела у пациенток с патологической гиперпролактинемией. Результаты настоящего исследования позволяют сделать вывод о том, что у больных с гиперпролактинемией АПАГ выявляются чаще, чем в здоровой популяции. Большая выявляемость положительных сывороток на опухолевых клетках человека позволяет предположить, что определяемые у больных с идиопатической гиперпролактинемией антигипофизарные антитела специфичны по отношению к поверхностным антигенам именно лактотрофов. Более того, высокая частота выявления АПАГ у больных этой группы свидетельствует о том, что нарушения гуморального аутоиммунитета могут играть существенную роль в формировании патологической гиперпролактинемии в отсутствие аденомы гипофиза. Известно, что одной из причин повышения уровня иммунореактивного Прл в сыворотке крови может быть повышение Прл-связывающей способности сыворотки крови вследствие присутствия аутоантител к Прл, которые определяются в сыворотке крови у 16-24% больных с гиперпролактинемией [6]. В связи с этим возникает вопрос, не являются ли антитела к поверхностным антигенам лактотрофов антителами к Прл? Для его решения были проведены исследования Прл-связывающей способности сыворотки крови и определение в одних и тех же сыворотках крови у больных с гиперпролактинемией опухолевого и неопухолевого генеза, а также у женщин с физиологической гиперпролактинемией. Исследование Прл-связывающей способности сыворотки крови было проведено у 11 женщин с идиопатической гиперпролактинемией, у 7 - с пролактиномами и у 12 - с физиологической гиперпролактинемией (см. таблицу). Среди больных с идиопатической гиперпролактинемией 7 пациенток были АПАГ-позитивными. Значительное повышение уровня Прл-связывающей способности сыворотки крови (более 10% для данного исследования), свидетельствующее о присутствии аутоантител к Прл, было отмечено у 3 из 11 женщин, однако только у 1 больной наблюдалось наличие и АПАГ, и аутоантител к Прл. Среди пациенток с пролактиномами Прл-связывающая способность Наличие АПАГ и Прл-связывающая способность сыворотки крови у пациенток с гиперпролактинемией различного генеза Вид гиперпролактинемии № Уровень Прл, мЕ/л Прл-связы- вающая способность, % АПАГ аденогипофиз крыс пролактинома человека Идиопати- 1 1187,6 6,3 + + ческая ги- 2 2302,8 5,6 + - перпро- 3 1277,3 6,9 лактине- мия 4 877,5 6,8 + + 5 1743,3 10,9 + + 6 2171,5 8 - + 7 2024 11,1 - - 8 1384 13,7 - - 9 1867 6,7 ± - 10 1647,7 5,3 + 4- 11 741 6,1 - + Опухоли ги- 1 1519 6,8 - - пофиза 2 1756 4,8 + + (пролакти- 3 5814 3,8 + + номы) 4 2240 3,4 + + 5 17 000 5,8 6 7725 9,5 7 6114 4,2 Физиологи- 1 3690 4 ческая ги- 2 4200 3,9 перпро- 3 6800 8 лактине- 4 5432 7,9 МИЯ 5 3780 7,9 6 4560 6,2 7 5890 6,4 8 6100 6,3 9 5123 4,6 10 3789 5,3 11 6180 5,2 12 4900 6,7 сыворотки крови не превышала 9,5%, т. е. достоверно аутоантитела к Прл не были выявлены ни в одном случае, в то время как у 3 женщин этой группы определялись АПАГ. Среди лиц с физиологической гиперпролактинемией повышения Прл- связывающей способности сыворотки крови не отмечено. Таким образом, в подавляющем большинстве случаев у пациенток с различными формами патологической гиперпролактинемии присутствие антител к Прл не совпадало с наличии антител к поверхностным антигенам клеток аденогипофиза. Результаты проведенного исследования подтверждают, что обнаруживаемые АПАГ и аутоантитела к Прл являются различными видами антител. В последнее время одной из причин различных гипофизарных расстройств считается лимфоцитарный аденогипофизит (ЛАГ). Первые описания этого заболевания касались патолого-анатомического материала, причем ЛАГ рассматривался как патологическое состояние у женщин послеродового периода, на фоне которого наблюдалось снижение уровня Прл [14]. К настоящему времени известно, что возникновение ЛАГ возможно как у женщин вне связи с беременностью и родами [12], так и у мужчин [10]. Примерно у половины больных с ЛАГ это может проявляться повышением содержания Прл в сыворотке крови [8, 12, 13]. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что у больных с идиопатической гиперпролактинемией возможной причиной заболевания может являться ЛАГ. Присутствие антител к поверхностным антигенам лактотрофов, выявленное в нашем исследовании у значительного числа пациенток с идиопатической гиперпролактинемией, позволяет предположить, что аутоиммунные нарушения играют важную роль в формировании повышенного уровня Прл в отсутствии Прл-секретирующей опухоли гипофиза. Выводы 1. АПАГ и антитела к Прл являются различными видами аутоантител, что подтверждается наличием в большинстве случаев только одного вида аутоантител в сыворотке крови. 2. Частота выявления АПАГ в крови больных с гиперпролактинемией опухолевого генеза достоверно не отличается при использовании различных антигеноносителей и составляет на клетках аденогипофиза крыс 18,7% и на клетках пролактиномы человека 29%. 3. Частота обнаружения АПАГ достоверно выше у пациенток с идиопатической гиперпролактинемией при использовании лактотрофов в качестве антигеноносителей (76,9%), чем при использовании клеток аденогипофиза крыс (38,5%). 4. АПАГ чаще выявляются в сыворотке крови больных с идиопатической гиперпролактинемией по сравнению с пролактиномами. Полученные данные свидетельствуют о том, что одной из причин идиопатической гиперпролактинемии могут быть аутоиммунные нарушения (лимфоцитарный гипофизит?).