Генетическая предрасположенность к развитию диффузного токсического зоба в популяции Москвы

Диффузный токсический зоб (ДТЗ, болезнь Грейвса) и аутоиммунный тиреоидит (АИТ) отно­сятся к аутоиммунным заболеваниям щитовидной железы, многофакторная природа которых была установлена еще в 80-х годах прошлого века. Эти болезни щитовидной железы являются одними из наиболее распространенных аутоиммунных забо­леваний. Они поражают до 0,5% населения и по своей встречаемости опережают даже сахарный диабет типа 1, причем женщины болеют ДТЗ в 9 раз чаще мужчин [10]. В развитии аутоиммунных забо­леваний щитовидной железы большую роль играет генетическая предрасположенность, что было об­наружено еще Бартелом в 1941 г. По его данным, более 40% пациентов имели семейный анамнез по патологии ЩЖ. Намного позже были обнаружены активация Т-лимфоцитов (CD4⁺) и/или снижение числа Т-супрессорных клеток (CD8⁺). Развитие ауто­иммунного процесса приводит к появлению разно­образных антител к ряду аутоантигенов. Наиболее значимыми из них являются антитела к рецептору тиреотропного гормона (ТТГ), которые вызывают гипертиреоз, имитируя связывание ТТГ с рецепто­ром. В связи с быстрым накоплением в последние годы данных о структурной организации генома человека и описанием множества полиморфных маркеров стало возможным изучение ассоциации потенциальных генов-кандидатов с наследствен­ными заболеваниями, в том числе и с аутоиммун­ными заболеваниями щитовидной железы.

Известно, что при ДТЗ аутоантитела к рецепто­ру ТТГ, которые часто называют тиреостимули­рующими иммуноглобулинами, связываются с ре­цептором ТТГ [2], приводя к активации аденилат- циклазы, увеличению синтеза и выброса гормонов, что и приводит к гипертиреозу. Поэтому ген рецеп­тора ТТГ (TSHR) может рассматриваться в качест­ве гена-кандидата при ДТЗ. В положении 253 той области гена TSHR, которая кодирует внеклеточ­ный домен рецепторной молекулы, обнаружен мо- нонуклеотидный полиморфизм, приводящий к аминокислотному полиморфизму в положении 52 (остаток пролина или треонина — Pro52Thr) [12].

Общеизвестными маркерами всех аутоиммун­ных заболеваний являются гены главного комплек­са гистосовместимости класса II, расположенные в локусе МНС (или HLA) на хромосоме 6р21. По всей видимости, участие локуса HLA в патогенезе ДТЗ связано с нарушениями иммунотолерантно­сти. Аберрантная экспрессия молекул МНС в клет­ках, синтезирующих нативный тиреотропин (TSH), может приводить к появлению функцио­нальных аутоантител к нему и индукции заболева­ния. Для анализа ассоциации локуса МНС с ДТЗ в данной работе использовали тетрануклеотидные микросателлитные маркеры D6S2414 и D6S1271, расположенные между генами МНС класса II.

Ассоциация с ДТЗ показана и для других генов, расположенных в локусе МНС, но не относящихся к генам HLA. Это семейство генов LMP, кодирую­щих субъединицы большой многофункциональной протеазы — сложного внутриклеточного фермента, осуществляющего процессинг антигенов. Ген LMP2, кодирующий р-субъединицу большой мно­гофункциональной протеазы 2, осуществляет рас­щепление белков на пептиды, которые затем по­ступают в эндоплазматический ретикулум, где вступают во взаимодействие с молекулами МНС класса I. В этом гене обнаружен мононуклеотид- ный полиморфизм, приводящий к аминокислотно­му полиморфизму: остатки аргинина (R) или гис­тидина (Н) в положении 60 аминокислотной по­следовательности — R60H [12].

Накоплены многочисленные данные об ассоциа­ции и сцеплении гена CTLA4 (2q33) с рядом ауто­иммунных заболеваний, в том числе с поражения­ми щитовидной железы. Современная модель ак­тивации Т-клеток предполагает наличие 2 сигна­лов: 1-й, специфический сигнал поступает в мо­мент связывания комплекса МНС с антигеном, на­ходящимся на поверхности клетки, представляю­щей антиген, с Т-клеточным рецептором (TCR), а 2-й, неспецифический сигнал поступает после со­единения другого рецептора Т-клетки (CD28) с его лигандами В7-1 (CD80) и В7-2 (CD86), также на­ходящимися на поверхности клетки, представляю­щей антиген. Часто 2-й сигнал называют костиму- лирующим. Если оба сигнала поступили, то имеют место активация Т-клетки, секреция цитокинов и дальнейшая пролиферация Т-клетки. Однако си­туация усложнилась после обнаружения другого рецептора (CTLA-4) с противоположным действи­ем, связывающегося с теми же лигандами В7-1 и В7-2, но переводящего Т-клетку в состояние "без­ответности" к данному антигену, называемое анер­гией, за которой следует программируемая смерть Т-клетки (апоптоз).

Нарушения в тонком взаимодействии рецепто­ров CD28 и CTLA-4 с лигандами В7-1 и В7-2 могут являться одной из причин аутоиммунных заболе­ваний. Например, это может произойти в том слу­чае, если в клетках тимуса часть аутореактивных Т- лимфоцитов, которые должны быть уничтожены, избежит апоптоза. В этом случае уцелевшие ауто­реактивные Т-лимфоциты уходят на периферию и до конца жизни могут не активироваться, однако возможен и другой вариант развития событий, при котором под воздействием внешних факторов мо­гут произойти активация аутореактивных Т-лим­фоцитов и развитие аутоиммунного заболевания. Ген CTLA4 является одним из наиболее вероятных генов-кандидатов, предрасполагающих к ДТЗ, и для изучения его ассоциации с ДТЗ использовали полиморфный маркер Alal7Thr (в положении 7 ли­дерного пептида), связанный с мононуклеотидным полиморфизмом (А -> G) в положении 49 экзона 1 (A49G) [1, 7].

Аутоиммунные поражения щитовидной железы часто сопровождаются воспалительными процес­сами, поэтому в числе генов-кандидатов, вовлечен­ных в развитие ДТЗ, могут рассматриваться гены, продукты которых являются медиаторами воспали­тельной реакции. К ним относится ген антагониста рецептора интерлейкина-1 (ILIRN), расположен­ный на хромосоме 2ql4.2, внутри которого нахо­дится полиморфный минисателлит [4].

Материалы и методы

В группу популяционного контроля вошли 153 донора (81 мужчина и 72 женщины) без патологии щитовидной железы (средний возраст 36,4 ± 10,4 года). Другую группу составили 78 больных с ДТЗ (14 мужчин и 64 женщины) в возрасте 39,3 ± 11,6 года с длительностью заболевания 4,1 ± 2,8 года. Группа обследованных состояла из лиц, наблюдав­шихся на кафедре эндокринологии и диабетологии ФППО ММА им. И. М. Сеченова.

Термостабильная ДНК-полимераза Taq получена от фирмы "Ферментас" (Вильнюс, Литва), протеи­наза К — от фирмы "Merck" (Германия). Синтез олигонуклеотидных праймеров выполнен ОАО "Синтол" (Москва). Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством фенол-хлоро­формной экстракции после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% SDS [13].

ДНК амплифицировали методом ПЦР на тер­моциклерах РНС-2 ("Techne", Великобритания) и "Терцик" (Россия) в 50 мкл реакционной смеси, со­держащей буфер 1 или 2, по 0,2 мМ каждого dNTP, по 10 пмоль каждого из праймеров, 100—200 нг ге­номной ДНК и 1,0 ед. ДНК-полимеразы Taq. Бу­фер 1 содержал 67 мМ трис-НС1 (pH 8,8), 16,6 мМ сульфат аммония и 0,1% твин-20. Концентрация хлорида магния зависела от амплифицируемого ло­куса. Буфер 2 содержал 10 мМ трис-НС1 (pH 8,8), 50 мМ КС1 и 1,5 мМ MgCl₂. При необходимости в реакционную смесь вносили ДМСО в конечной концентрации 10%.

На первой стадии ПЦР ДНК денатурировали при 94°С 3 мин, на конечной — проводили синтез 2-й цепи при 72°С 7 мин. В промежутке между дан­ными стадиями осуществляли 25—35 циклов ПЦР в зависимости от локуса и количества исходной ДНК по трехступенчатой программе, включающей в себя денатурацию ДНК при 94°С 1 мин, отжиг праймеров в течение 1 мин и синтез 2-й цепи при 72°С 1 мин. Температура отжига праймеров зави­села от амплифицируемого локуса. Условия ПЦР и

последовательности праймеров для амплификации исследованных локусов приведены в табл. 1.

Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили в 12% полиакриламидном геле, который затем окрашивали нитратом серебра [11].

Для идентификации аллелей полиморфного маркера гена LMP2 использовали рестриктазу Hin6I, в случае полиморфного маркера гена CTLA4

• рестриктазу Mbol и в случае полиморфного мар­кера гена TSHR — рестриктазу Psyl. К 15 мкл ам- плифицированного фрагмента ДНК добавляли 2 мкл 10-кратного буфера, 2 мкл БСА (1 мг/мл) и 1— 3 ед. фермента. Расщепление ДНК рестриктазами Mbol и Psyl проводили в буфере R, а рестриктазой Hin6I — в буфере Y в течение 3—4 ч при 37°С.

Значимость различий между частотами аллелей и генотипов исследованных полиморфных марке­ров в группах определяли с помощью точного кри­терия Фишера с поправкой Бонферрони, учиты­вающей число аллелей и генотипов. Значимыми считали различия при р < 0,05. Для оценки роли генетического маркера (аллеля или генотипа) в раз­витии ДТЗ рассчитывали значения относительного риска (OR). OR = 1 рассматривали как отсутствие ассоциации, OR > 1 — как фактор риска и OR < 1

• как фактор, предохраняющий от развития пато­логии.

Результаты и их обсуждение

Для маркера D6S2414 было обнаружено 9 алле­лей, содержащих от 5 до 13 повторов (по числу по­вторяющихся единиц gata). Значимыми оказались различия в распределении частот для аллелей 5, 6, 8, 12, причем содержание аллелей 5, 6 и 12 у боль­ных было снижено, а аллеля 8 — повышено, что от­ражает величина OR, т. е. пациенты — носители аллелей 5, 6 и 12 в большей степени предрасполо­жены к развитию ДТЗ, в то время как носители ал­леля 8, по всей видимости, имеют меньший риск развития ДТЗ (табл. 2).

Для маркера D6S1271 было обнаружено 4 алле­ля, содержащих от 10 до 13 повторов. У пациентов с ДТЗ достоверно повышена частота аллеля 10 по сравнению с контрольной группой. Аллель 10 об­ладает наибольшим значением OR (4,95). Следова­тельно, данный аллель можно рассматривать в ка­честве своеобразного маркера повышенного риска развития ДТЗ. В то же время у больных существен­но снижено содержание аллеля 13, характеризую­щегося минимальными значениями OR, что фор­мально свидетельствует о его предохраняющей ро­ли по отношению к раннему развитию аутоиммун­ной патологии. Достоверные различия показаны и в распределении генотипов маркера D6S1271. У па­циентов с ДТЗ по сравнению с контролем сущест­венно повышена доля генотипа 10/12. Носительст­во генотипа 10/12 ассоциировано с максимальным (OR = 4,99) риском развития ДТЗ.

Таким образом, наличие значимых различий во встречаемости 4 аллелей для маркера D6S2414 и 2 аллелей и 1 генотипа для маркера D6S1271 нагляд­но свидетельствует о выраженной ассоциации этих маркеров и окружающей их хромосомной области 6р21.31 с развитием ДТЗ в московской популяции.

Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера R60H гена LMP2 в группах с ДТЗ и в популяционном контро­ле выявил тенденцию к накоплению аллеля R и особенно генотипа RR (в 2,5 раза) у больных с ДТЗ по сравнению с контролем. Достоверным было лишь возрастание содержания генотипа RR, значи­мость которого исчезала при введении поправки Бонферрони (см. табл. 2). В настоящий момент не совсем ясно, ассоциирован ли полиморфный мар­кер R60H гена LMP2 с развитием ДТЗ. Во всяком случае, в популяции Москвы предрасполагающий эффект данного генотипа выражен сильнее, чем предохраняющая роль гомозигот НН, но при этом выраженная связь с патологией у полиморфного маркера R60H гена LMP2 отсутствует.

В нашей работе также обнаружена выраженная ассоциация полиморфного маркера Alal7Thr гена CTLA4 с ДТЗ. Из табл. 2 видно, что носители мо­лекулярного варианта Т-клеточной эстеразы, несу­щей остаток аланина в положении 17 (аллель Ala 17), и гомозиготные носители этого аллеля име­ют повышенный риск развития ДТЗ (OR = 2,94 и 3,57 соответственно), тогда как носители аллеля Thr 17 и особенно гомозиготные носители этого ал­леля имеют пониженный риск развития ДТЗ в мо­сковской популяции (OR = 0,34 и 0,28 соответст­венно).

Таблица 2

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных марке­ров в группах больных с ДТЗ и здоровых индивидов

Аллели и значимые генотипы

OR

Значения критерия Фишера

Значения критерия Фишера с учетом по­правки Бон­феррони

D6S2414

D6S1271

Ген CTLA4

Ген LMP2

Ген TSHR

В интроне 2 гена IL1RN расположен полиморф­ный минисателлит, состоящий из повторяющихся звеньев размером 86 п. н. При генетическом ана­лизе было выявлено 5 аллелей. Сравнительный анализ выявил достоверные различия в частотах аллеля 2 и 2 генотипов (2/4 и 4/4) между группой здоровых доноров и больными с ДТЗ. У последних содержание данного аллеля (38,5%) и гетерозигот 2/4 (61,5%) было существенно повышено, тогда как доля гомозигот 4/4 (23,1%) значительно уменьшена по сравнению с контролем. Таким образом, гено­тип 2/4 (OR = 2,61) может служить маркером рис­ка развития ДТЗ (см. табл. 2). Возможно, ген IL1RN ассоциирован с ДТЗ в московской популя­ции.

Проведенный нами анализ полиморфного мар­кера Pro52Thr гена рецептора ТТГ не показал ассо­циации с заболеванием (см. табл. 2). В настоящий момент неясно, связано ли это с тем, что ген TSHR не вовлечен в патогенез ДТЗ, либо только с тем, что использованный нами полиморфный маркер не ас­социирован с ДТЗ. Нельзя исключить, что какой- либо другой полиморфный маркер в гене TSHR может быть ассоциирован с развитием аутоиммун­ного ДТЗ. В ближайшее время планируется осуще­ствить анализ ассоциации с ДТЗ ряда других мар­керов этого гена.

Выводы

1. Не обнаружено ассоциации между полиморф­ными маркерами R60H гена LMP2 и Pro52Thr гена TSHR и ДТЗ.
2. Изучена ассоциация с ДТЗ 2 полиморфных тетрануклеотидных микросателлитов D6S2414 и D6S1271, расположенных в области генов МНС. Выявлены достоверные различия в частотах встре­чаемости 4 аллелей маркера D6S2414 и 2 аллелей и 1 генотипа маркера D6S1271 в группах больных с ДТЗ и здоровых индивидов в московской популя­ции. При этом зафиксировано наибольшее значе­ние OR для генотипа 10/12 маркера D6S1271, рав­ное 4,99.
3. Одним из важнейших маркеров, связанных с предрасположенностью к ДТЗ, является поли­морфный маркер Alal7Thr гена CTLA4, для всех аллелей и гомозиготных генотипов которого пока­зана высокодостоверная ассоциация с ДТЗ. При этом обнаружена корреляция между носительством аллеля А1а17 и генотипа Ala/Ala и повышенным риском развития ДТЗ (OR = 2,94 и 3,57 соответст­венно), тогда как носительство аллеля Thr 17 и осо­бенно гомозиготы Thr/Thr коррелирует со снижен­ным (OR = 0,34 и 0,28 соответственно) риском раз­вития ДТЗ.
4. Минисателлитный полиморфный маркер в гене IL1RN ассоциирован с развитием ДТЗ в мос­ковской популяции.