Preview

Проблемы Эндокринологии

Расширенный поиск

Влияние метилирования ДНК на изменение структуры хроматина при тиреоидной патологии

https://doi.org/10.14341/probl11632

Полный текст:

Аннотация

При различных формах тиреоидной патологии наблюдается нарушение регуляции экспрессии гена тиреоглобулина (ТГ). Это нарушение лучше всего объясняется транскрипционными событиями, которые зависят не только от первичной последовательности нуклеотидов в структуре ДНК, но и от структурно-функциональных изменений в хроматине клеток щитовидной железы. Механизмом, регулирующим транскрипцию гена ТГ, является метилирование ДНК. Метилирование ДНК существенно влияет как на структуру самой ДНК, на ДНКазачувствительные участки, так и на взаимодействие ДНК с различными белками, включая РНК-полимеразу.


ДНКаза I-гиперчувствительность метилированного хроматина в ядрах клеток щитовидной железы при диффузном токсическом зобе по выходу гидролизованной ДНК из ядер составила 10%, в то время как ДНКаза 1-гиперчувствительность неметилированного хроматина в изолированных ядрах - 50%. При узловом эутиреоидном зобе ДНКаза /-гиперчувствительность метилированного хроматина составляла 7%, а неметилированного - 10%. Гиперчувствительность неметилированного хроматина в изолированных ядрах при врожденном зобе равна нулю.


Изучение РНК-полимеразной активности ядер из клеток щитовидной железы под влиянием метилирования показало значительное уменьшение синтеза РНК независимо от вида патологии.

Для цитирования:


Кадырова Д.А., Артыкбаева Г.М., Туракулов Я.X. Влияние метилирования ДНК на изменение структуры хроматина при тиреоидной патологии. Проблемы Эндокринологии. 2003;49(3):46-47. https://doi.org/10.14341/probl11632

For citation:


Kadyrova D.A., Artykbayeva G.M., Turakulov Y.K. Effects of DNA methylation on the altered structure of chromatin in thyroid disease. Problems of Endocrinology. 2003;49(3):46-47. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11632

Выявление факторов, определяющих потенциально активное состояние генов и обеспечивающих активацию их транскрипции, чрезвычайно важно для понимания механизмов регуляции генов. В связи с этим необходимо выявление особенностей структуры функционально различных участков хроматина. В большинстве случаев нарушение регуляции экспрессии гена тиреоглобулина (ТГ) лучше всего объясняется транскрипционными событиями, которые зависят не только от первичной последовательности нуклеотидов в структуре ДНК, но и от структурно-функциональных изменений в хроматине клеток щитовидной железы. Механизмом, регулирующим транскрипцию гена ТГ, является метилирование ДНК. Метилирование ДНК существенно влияет как на структуру самой ДНК, на ДНКаза-чув- ствительные участки, так и на взаимодействие ДНК с различными белками, включая РНК-полимеразу.

Изменения структуры хроматина, выявляемые ДНКазой I, по-видимому, формируются вслед за изменением картины метилирования, т. е. опосредованное метилирование, связанное с изменением структуры хроматина 5'-области гена ТГ, возможно, делает его компетентным к транскрипции.

В данной статье было проведено изучение влияния метилирования на ДНКаза 1-гиперчувствительность и РНК-полиме- разную активность хроматина ядер клеток щитовидной железы при патологии.

Материалы и методы

Использовали щитовидные железы людей, удаленные во время операции в лаборатории тиреоидной патологии Института эндокринологии Минздрава Республики Узбекистан.

Ядра из клеток щитовидной железы выделяли осаждением их в 0,25 М сахарозе, содержащей 5 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрей- тола (ДТТ), 10 мМ трис-НС1 pH 7,5 (буфер А), и дальнейшей очисткой их путем наслоения на раствор 2 М сахарозы в буфере А (24 000 об/мин, 1 ч, ротор "SW-27 Beeman"). Во все буферные растворы добавляли фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) до концентрации 1 мМ. Ядра после плотной сахарозы отмывали буфером А.

Реакция гомологичного метилирования с использованием ДНК- метилаз содержала следующие компоненты: 25 мкг ядерной ДНК щитовидной железы, 100-200 мкг ДНК-метилазы, 7,5 мк/Ки 5 метил-’Н-аденозинметионина, 150-250 мкл инкубационного буфера, содержащего 10 мМ трис-НС1 pH 7,5, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,2 мМ ФМСФ, 10% глицерина. Объем инкубационной пробы составлял 0,3 мл. Смесь инкубировали 6 ч при 37‘С. По окончании реакции метилирования ДНК осаждали 5% ТХУК, осадок переносили на мембранный фильтр, промывали 5% ТХУК и этанолом, затем измеряли радиоактивность на счетчике "Магк-ПГ.

Для определения ДНКаза 1-чувствительности проводили обработку ядер ДНКазой I (2000 Ед/мг, "Serva”) в следующих условиях: ядра (1 мг ДНК) суспендировали в среде, содержащей 0,25 мМ сахарозы, 3 мМ MgCl2, 0,3 мМ СаС12, 10 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ, 10 мМ трис-НС1 pH 8,6, инкубировали при 4”С в течение 5 мин с различными концентрациями ДНКазы I (от 0,1 до 100 Ед/мл) или с фиксированной концентрацией фермента (20 Ед/мл) при 37*С в течение 15 мин. Гидролиз ДНК останавливали переводом проб в ледяную кислоту с добавлением ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ. Смесь центрифугировали и в супернатанте определяли количество гидролизованной ДНК, а также величину ’Н-радиоактивности, просчитывая ее на счетчике "Mark". Концентрацию ДНК в ядрах определяли по Бартону 11 ], а также спектрофотометрически, принимая, что

ДНКаза-гиперчувствительность метилированного хроматина ядер клеток щитовидной железы.

/ - диффузный токсический зоб; 2 - узловой эутиреоидный зоб; 3 - врожденный зоб.

По оси ординат - гибридизуемость (в %); по оси абсцисс - время инкубации с ДНКазой I (в мин).

20 Ед Д в 0,1 % растворе додецилсульфата натрия соответствует 1 мг ДНК в 1 мл.

Общую РНК-полимеразную активность метилированных ядер определяли в среде, содержащей в объеме 0,25 мл следующие компоненты: 60 мМ трис-НС1 pH 7,5, 1 мМ MgCI2, 5 мМ МпС12, 1 мМ ДТТ, 200 мМ (NH)2SO4, АТФ, ГТФ, УТФ по 0,4 мМ, 0,01 мМ 3Н-ЦТФ (13,4 мкКи/моль) и суспензию клеточных ядер (100-150 мкгДНК). Время инкубирования при ЗО'С составляло 30 мин. Реакцию останавливали охлажденной 10% ТХУК. Осадки собирали на миллипоровые фильтры, промывали их небольшими порциями 5% ТХУК, 5% пирофосфата натрия, этанола и подсчитывали ’Н-радиоактивность.

Результаты и их обсуждение

Изучение особенностей метилирования гена ТГ показало, что модификации подвергается 5'-концевой цитозин и более длинные последовательности состава 5'-CCGG-3', и деметилирование этого участка коррелирует с экспрессией гена ТГ, т. е. между метилированием ДНК и экспрессией гена ТГ существует обратная корреляция. Появление в хроматине участков, гиперчувствительных к ДНКазе I, связано с транскрипционной активностью. В связи с этим было интересно изучить влияние метилирования ДНК на ДНКаза I-гиперчувствительность хроматина ядер клеток щитовидной железы при тиреоидной патологии.

ДНКаза 1-гиперчувствительность метилированного хроматина в ядрах клеток щитовидной железы при диффузном токсическом зобе по выходу гидролизованной ДНК из ядер составила 10%, в то время как ДНКаза I-гиперчувствительность неметилированного хроматина в изолированных ядрах - 50%. При узловом эутиреоидном зобе ДНКаза 1-гиперчувствительность метилированного хроматина составляла 7%, а неметилированного - 10%. Гиперчувствительность неметилированного хроматина в изолированных ядрах при врожденном зобе равна нулю (см. рисунок).

РНК-полимераза выполняет исключительно важную функцию: запускает процесс реализации генетической информации с соответствующих ДНК и осуществляет регуляцию активности генов на уровне транскрипции. Было изучено влияние метилирования ДНК на РНК-полимеразную активность ядер клеток щитовидной железы.

Общая РНК-полимеразная активность ядер из клеток щитовидной железы под влиянием метилирования была изучена

РНК-полимеразная активность изолированных ядер клеток щитовидной железы (М ± т)

Патология

Нормальные ядра

Метилированные ядра

Нормальные ядра

Метилированные ядра

3Н-УМФ, имп/мин

%

Диффузный ток

сический зоб   1800 ± 24 700 ± 12 100 ± 12                   40

Узловой эутирео

идный зоб     1000 ± 48 200 ± 26            82 ± 16          10,5 при узловом эутиреоидном и диффузном токсическом зобе. Результаты этих исследований представлены в таблице.

Из представленных данных видно, что под влиянием метилирования происходит значительное уменьшение биосинтеза РНК независимо от вида патологии. Нами показано уменьшение активности РНК-полимеразы ядер клеток щитовидной железы под влиянием метилирования.

Таким образом, показано наличие обратной корреляции между уровнем метилирования ДНК и генной активностью, т. е. повышение уровня метилирования ДНК сопровождается потерей сверхчувствительности к ДНКаза 1-участкам, уменьшением активности РНК-полимеразы и блоком транскрипции.

В хроматине ядер клеток щитовидной железы было обнаружено 2 района, гиперчувствительных к ДНКазе I, в 7 т. п. н. в сегменте 5'-фланкирующих последовательностей гена ТГ. ДНКаза-чувствительность может возникать вследствие взаимодействия с ДНК-связывающими факторами [3]. Однако другие механизмы также могут принимать участие в формировании этого измененного свойства хроматина. Среди них первое место занимают суперспирализация [4] и метилирование |5]. При изучении взаимосвязи между экспрессией гена ТГ и его метилированием показано, что чувствительные к метилированию сайты, расположенные в 5'-фланкирующей области гена, гиперметилируются при раке щитовидной железы, в то время как при диффузном токсическом зобе наблюдается недометилирование этих сайтов [2].

Деметилирование гена ТГ является сигналом, детерминирующим возможность его экспрессии. В целом это относится в основном к состоянию 5'-области гена. Последовательности ДНК, соответствующие ДНКаза 1-гиперчувствительным сайтам, демонстрируют свойства транскрипционного гена-усилителя. При гиперметилировании эти участки теряют свойства гена-усилителя. Метилирование и деметилирование обеспечивает стабильное изменение структуры гена и играет важную роль в регуляции генной активности.

Выводы

  1. Показано наличие обратной корреляции между уровнем метилирования ДНК и активностью гена при тиреоидной патологии.
  2. Под влиянием метилирования ДНК происходят уменьшение активности РНК-полимеразы и блок транскрипции.

Список литературы

1. Бартон К. Методы исследования нуклеиновых кислот. - М., 1970. - С. 7-9.

2. Berlingier М. Т., Mosti А. М., Avvedimento V. Е. et al. // Exp. Cell. Res. - 1985. - Vol. 163. - P. 277-283.

3. Hansen S., Christophe D., Vassart G. // Arch. Physiol. Biochem. - 1995. - Vol. 94, N 1. - P. 1322-1329.

4. Romanes T. // Rev. Biochem. - 1992. - Vol. 51. - P. 93- 121.

5. Libert P., Vassart G. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1996. - Vol. 134. - P. 1109-1116.


Об авторах

Д. А. Кадырова

Институт биохимии АН Республики Узбекистан


Узбекистан


Г. М. Артыкбаева

Институт биохимии АН Республики Узбекистан


Узбекистан


Я. X. Туракулов

Институт биохимии АН Республики Узбекистан


Узбекистан


Рецензия

Для цитирования:


Кадырова Д.А., Артыкбаева Г.М., Туракулов Я.X. Влияние метилирования ДНК на изменение структуры хроматина при тиреоидной патологии. Проблемы Эндокринологии. 2003;49(3):46-47. https://doi.org/10.14341/probl11632

For citation:


Kadyrova D.A., Artykbayeva G.M., Turakulov Y.K. Effects of DNA methylation on the altered structure of chromatin in thyroid disease. Problems of Endocrinology. 2003;49(3):46-47. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11632

Просмотров: 206


ISSN 0375-9660 (Print)
ISSN 2308-1430 (Online)