Влияние метилирования ДНК на изменение структуры хроматина при тиреоидной патологии

Выявление факторов, определяющих потенциально активное состояние генов и обеспечивающих активацию их транскрипции, чрезвычайно важно для понимания механизмов регуляции генов. В связи с этим необходимо выявление особенностей структуры функционально различных участков хроматина. В большинстве случаев нарушение регуляции экспрессии гена тиреоглобулина (ТГ) лучше всего объясняется транскрипционными событиями, которые зависят не только от первичной последовательности нуклеотидов в структуре ДНК, но и от структурно-функциональных изменений в хроматине клеток щитовидной железы. Механизмом, регулирующим транскрипцию гена ТГ, является метилирование ДНК. Метилирование ДНК существенно влияет как на структуру самой ДНК, на ДНКаза-чув- ствительные участки, так и на взаимодействие ДНК с различными белками, включая РНК-полимеразу.

Изменения структуры хроматина, выявляемые ДНКазой I, по-видимому, формируются вслед за изменением картины метилирования, т. е. опосредованное метилирование, связанное с изменением структуры хроматина 5'-области гена ТГ, возможно, делает его компетентным к транскрипции.

В данной статье было проведено изучение влияния метилирования на ДНКаза 1-гиперчувствительность и РНК-полиме- разную активность хроматина ядер клеток щитовидной железы при патологии.

Материалы и методы

Использовали щитовидные железы людей, удаленные во время операции в лаборатории тиреоидной патологии Института эндокринологии Минздрава Республики Узбекистан.

Ядра из клеток щитовидной железы выделяли осаждением их в 0,25 М сахарозе, содержащей 5 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрей- тола (ДТТ), 10 мМ трис-НС1 pH 7,5 (буфер А), и дальнейшей очисткой их путем наслоения на раствор 2 М сахарозы в буфере А (24 000 об/мин, 1 ч, ротор "SW-27 Beeman"). Во все буферные растворы добавляли фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) до концентрации 1 мМ. Ядра после плотной сахарозы отмывали буфером А.

Реакция гомологичного метилирования с использованием ДНК- метилаз содержала следующие компоненты: 25 мкг ядерной ДНК щитовидной железы, 100-200 мкг ДНК-метилазы, 7,5 мк/Ки 5 метил-’Н-аденозинметионина, 150-250 мкл инкубационного буфера, содержащего 10 мМ трис-НС1 pH 7,5, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,2 мМ ФМСФ, 10% глицерина. Объем инкубационной пробы составлял 0,3 мл. Смесь инкубировали 6 ч при 37‘С. По окончании реакции метилирования ДНК осаждали 5% ТХУК, осадок переносили на мембранный фильтр, промывали 5% ТХУК и этанолом, затем измеряли радиоактивность на счетчике "Магк-ПГ.

Для определения ДНКаза 1-чувствительности проводили обработку ядер ДНКазой I (2000 Ед/мг, "Serva”) в следующих условиях: ядра (1 мг ДНК) суспендировали в среде, содержащей 0,25 мМ сахарозы, 3 мМ MgCl₂, 0,3 мМ СаС1₂, 10 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ, 10 мМ трис-НС1 pH 8,6, инкубировали при 4”С в течение 5 мин с различными концентрациями ДНКазы I (от 0,1 до 100 Ед/мл) или с фиксированной концентрацией фермента (20 Ед/мл) при 37*С в течение 15 мин. Гидролиз ДНК останавливали переводом проб в ледяную кислоту с добавлением ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ. Смесь центрифугировали и в супернатанте определяли количество гидролизованной ДНК, а также величину ’Н-радиоактивности, просчитывая ее на счетчике "Mark". Концентрацию ДНК в ядрах определяли по Бартону 11 ], а также спектрофотометрически, принимая, что

ДНКаза-гиперчувствительность метилированного хроматина ядер клеток щитовидной железы.

/ - диффузный токсический зоб; 2 - узловой эутиреоидный зоб; 3 - врожденный зоб.

По оси ординат - гибридизуемость (в %); по оси абсцисс - время инкубации с ДНКазой I (в мин).

20 Ед Д_2М в 0,1 % растворе додецилсульфата натрия соответствует 1 мг ДНК в 1 мл.

Общую РНК-полимеразную активность метилированных ядер определяли в среде, содержащей в объеме 0,25 мл следующие компоненты: 60 мМ трис-НС1 pH 7,5, 1 мМ MgCI₂, 5 мМ МпС1₂, 1 мМ ДТТ, 200 мМ (NH)₂SO₄, АТФ, ГТФ, УТФ по 0,4 мМ, 0,01 мМ ³Н-ЦТФ (13,4 мкКи/моль) и суспензию клеточных ядер (100-150 мкгДНК). Время инкубирования при ЗО'С составляло 30 мин. Реакцию останавливали охлажденной 10% ТХУК. Осадки собирали на миллипоровые фильтры, промывали их небольшими порциями 5% ТХУК, 5% пирофосфата натрия, этанола и подсчитывали ’Н-радиоактивность.

Результаты и их обсуждение

Изучение особенностей метилирования гена ТГ показало, что модификации подвергается 5'-концевой цитозин и более длинные последовательности состава 5'-CCGG-3', и деметилирование этого участка коррелирует с экспрессией гена ТГ, т. е. между метилированием ДНК и экспрессией гена ТГ существует обратная корреляция. Появление в хроматине участков, гиперчувствительных к ДНКазе I, связано с транскрипционной активностью. В связи с этим было интересно изучить влияние метилирования ДНК на ДНКаза I-гиперчувствительность хроматина ядер клеток щитовидной железы при тиреоидной патологии.

ДНКаза 1-гиперчувствительность метилированного хроматина в ядрах клеток щитовидной железы при диффузном токсическом зобе по выходу гидролизованной ДНК из ядер составила 10%, в то время как ДНКаза I-гиперчувствительность неметилированного хроматина в изолированных ядрах - 50%. При узловом эутиреоидном зобе ДНКаза 1-гиперчувствительность метилированного хроматина составляла 7%, а неметилированного - 10%. Гиперчувствительность неметилированного хроматина в изолированных ядрах при врожденном зобе равна нулю (см. рисунок).

РНК-полимераза выполняет исключительно важную функцию: запускает процесс реализации генетической информации с соответствующих ДНК и осуществляет регуляцию активности генов на уровне транскрипции. Было изучено влияние метилирования ДНК на РНК-полимеразную активность ядер клеток щитовидной железы.

Общая РНК-полимеразная активность ядер из клеток щитовидной железы под влиянием метилирования была изучена

РНК-полимеразная активность изолированных ядер клеток щитовидной железы (М ± т)

Диффузный ток

сический зоб   1800 ± 24 700 ± 12 100 ± 12                   40

Узловой эутирео

идный зоб     1000 ± 48 200 ± 26            82 ± 16          10,5 при узловом эутиреоидном и диффузном токсическом зобе. Результаты этих исследований представлены в таблице.

Из представленных данных видно, что под влиянием метилирования происходит значительное уменьшение биосинтеза РНК независимо от вида патологии. Нами показано уменьшение активности РНК-полимеразы ядер клеток щитовидной железы под влиянием метилирования.

Таким образом, показано наличие обратной корреляции между уровнем метилирования ДНК и генной активностью, т. е. повышение уровня метилирования ДНК сопровождается потерей сверхчувствительности к ДНКаза 1-участкам, уменьшением активности РНК-полимеразы и блоком транскрипции.

В хроматине ядер клеток щитовидной железы было обнаружено 2 района, гиперчувствительных к ДНКазе I, в 7 т. п. н. в сегменте 5'-фланкирующих последовательностей гена ТГ. ДНКаза-чувствительность может возникать вследствие взаимодействия с ДНК-связывающими факторами [3]. Однако другие механизмы также могут принимать участие в формировании этого измененного свойства хроматина. Среди них первое место занимают суперспирализация [4] и метилирование |5]. При изучении взаимосвязи между экспрессией гена ТГ и его метилированием показано, что чувствительные к метилированию сайты, расположенные в 5'-фланкирующей области гена, гиперметилируются при раке щитовидной железы, в то время как при диффузном токсическом зобе наблюдается недометилирование этих сайтов [2].

Деметилирование гена ТГ является сигналом, детерминирующим возможность его экспрессии. В целом это относится в основном к состоянию 5'-области гена. Последовательности ДНК, соответствующие ДНКаза 1-гиперчувствительным сайтам, демонстрируют свойства транскрипционного гена-усилителя. При гиперметилировании эти участки теряют свойства гена-усилителя. Метилирование и деметилирование обеспечивает стабильное изменение структуры гена и играет важную роль в регуляции генной активности.

Выводы

1. Показано наличие обратной корреляции между уровнем метилирования ДНК и активностью гена при тиреоидной патологии.
2. Под влиянием метилирования ДНК происходят уменьшение активности РНК-полимеразы и блок транскрипции.