Снижение чувствительности к глюкокортикоидам как фактор стрессогенных сдвигов активности моноаминоксидазы, перекисного окисления липидов и поведения у крыс

Повторные эпизоды стрессовых воздействий, как и одно­кратный тяжелый стресс, снижают чувствительность тканей к глюкокортикоидным гормонам (ГКГ) [4, 19]. На уровне гипо­таламуса и гиппокампа этот общеизвестный феномен обуслов­ливает нарушение регуляции гипоталамо-гипофизарно-надпо- чечниковой системы (ГГНС) по механизму "длинной петли" от­рицательной обратной связи [15, 19]. В результате снижается ог­раничительный контроль секреции кортиколиберина (КЛ) и развивается центральный гиперкортицизм, сопровождающийся расстройствами поведения по типу меланхолической депрессии [ 15]. Депрессивная симптоматика, возникающая на таком фоне, рассматривается в связи с анксиогенным и анорексигенным эф­фектами КЛ [15]. Однако не исключено, что стрессиндуциро- ванное снижение церебральной чувствительности к ГКГ может вызывать тревожно-депрессивные расстройства через альтерна­тивные, относительно КЛ-независимые механизмы. По-види­мому, к числу этих механизмов можно отнести стрессиндуци- рованные сдвиги активности моноаминоксидазы [МАО; амин- кислородоксидоредуктаза (дезаминирующая, содержащая фла­вин); КФ 1.4.3.4], являющейся объектом разносторонней ГКГ- зависимой регуляции [13, 20], которая осуществляет катаболизм моноаминов-нейротрансмиттеров и во многом определяет ней­рохимический контроль поведения [6]. Известно, что в голов­ном мозге и печени ГКГ стимулируют биосинтез МАО [6, 13], но одновременно оказывают ингибиторное действие на предсу- ществующие молекулы фермента [20]. Стоит добавить, что ак­тивность МАО рассматривается как значимый фактор индукции свободнорадикального повреждения и инволютивных процес­сов в нервной ткани [8].

Представленная статья посвящена рассмотрению взаимо­связей между постстрессорными сдвигами чувствительности к ГКГ у крыс, поведением животных в "открытом поле", актив­ностью МАО и свободнорадикальным (перекисным) окислени­ем липидов в головном мозге, печени и почках.

Материалы и методы

Исследование выполнено на 48 половозрелых беспородных крысах обоего пола массой 140-160 г, которые были равномер­но распределены на 4 экспериментальные группы. Крыс 2 изу­ченных групп подвергали 4-кратному иммобилизационному стрессу по методу В. Э. Цейликмана и соавт. [11]. Длительность однократной иммобилизации составляла 60 мин, стрессовые воздействия повторяли с интервалом в 72 ч. Через 24 ч после за­вершения последнего сеанса иммобилизации изучали поведе­ние крыс в "открытом поле" (I серия тестирования). Затем жи­вотных наркотизировали диэтиловым эфиром, взвешивали и подкожно вводили им пролонгированный глюкокортикоидный препарат "Кеналог" ("Berlin-Chemie", Германия) в дозе 2 мг/кг, животные другой группы получали эквиобъемное количество 0,9% NaCl. Еще 2 группы крыс получали аналогичные инъекции без предварительного стрессирования (контроль).

Использованное в работе "открытое поле" представляло со­бой манеж (размером 80 х 80 см), разделенный на квадраты со стороной 20 см, в центре каждого квадрата находилось отвер­стие диаметром 3,8 см, высота боковых стенок актографа со­ставляла 47 см [3, 12]. Поведение каждого животного в "откры­том поле" изучали в течение 10 мин. Проводили регистрацию двигательной активности, ориентировочной реакции, исследо­вательского поведения, груминга и анксиогенной дефекации.

Через 96 ч с момента подкожного введения кеналога или 0,9% NaCl крыс повторно тестировали в "открытом поле" (II се­рия тестирования) и забивали под эфирным наркозом. Чувст­вительность к ГКГ оценивали по степени кеналогиндуцирован- ного снижения массы вилочковой железы [4, 12]. В гомогенатах головного мозга, печени и почек определяли активность МАО с солянокислым бензиламином в качестве субстрата [2, 12]. Ис­пользованный метод предназначен для определения активности МАО-Б, которая является преобладающей формой фермента в мозге человека и крысы [16, 18]. Поскольку иммобилизацион­ный стресс может вызвать изменение удельного содержания белка и воды в тканях [5], активность МАО выражали в нано­молях бензальдегида в расчете на цельный орган (абсолютная ферментативная активность).

Тканевое содержание продуктов перекисного окисления ли­пидов (ПОЛ) изучали с помощью экстракционно-спектрофото­метрического метода [1, 6]. Примененный метод позволяет осу­ществлять дифференцированное определение переокисленных ациллов в структуре фосфолипидов, извлекаемых изопропаноль- ной фазой, и неэтерифицированных интермедиатов пероксида­ции жирных кислот, экстрагируемых гептановой фазой. Резуль­таты выражали в единицах индексов окисления - Е₂₃₂/Е₂₂₀ (от­носительное содержание диеновых конъюгатов - ДК) и Е₂₇₈/Е₂₂₀ (уровень кетодиенов - КД - и сопряженных триенов - СТ).

Результаты обработаны статистически. О достоверности различий судили по критериям Стьюдента (/), Вилкоксона- Манна-Уитни (U) и Колмогорова-Смирнова (А.). В качестве показателя связи между изучаемыми параметрами рассчитыва­ли коэффициент линейной корреляции (г) и коэффициент кор­реляции рангов Кендела (rj.

Результаты и их обсуждение

В результате проведенного исследования было установлено, что 4-кратный иммобилизационный стресс вызывает снижение поведенческой активности крыс. Это проявилось уменьшением показателей локомоции и исследовательского поведения живот­ных при I тестировании в "открытом поле" (табл. 1). Одновре­менно наблюдалось увеличение показателя анксиогенной дефе­кации, что свидетельствует о гомологичности стрессиндуциро- ванных расстройств поведения у крыс и меланхолической де­прессии у человека [15]. Данный тип психических расстройств рассматривается как следствие гипоталамической гиперпродук­ции КЛ, который считается центральным медиатором стрессо­генной тревожности [15].

Введение кеналога интактным крысам вызвало снижение показателей ориентировочной реакции и поведения самоочист- ки (груминга) во II серии тестирования (см. табл. 1). При этом показатель анксиогенной дефекации не только не увеличивал­ся, но даже проявлял заметную тенденцию к снижению отно­сительно контроля. Скорее всего приведенные факты отражают дефицит гипоталамической продукции КЛ в связи с введением экзогенного глюкокортикоидного препарата. Подобный меха­низм описан в литературе как причина поведенческой депрес­сии при АКТГ-продуцирующих аденомах гипофиза [15]. Важно подчеркнуть, что депрессивные расстройства такого рода прин­ципиально отличаются по механизму своего развития от мелан­холической депрессии и являются гомологом так называемой атипичной депрессии [15].

Повторное тестирование контрольных крыс в "открытом по­ле" также сопровождалось уменьшением их исследовательской, ориентировочной и двигательной активности (см. табл. 1). Та­кой феномен обычно трактуется как следствие габитуации, т. е. адаптации к условиям актографа [12]. Подобная трактовка не­применима к схеме эксперимента, использованной в данном исследовании. Это связано с амнезирующим эффектом эфир­ного наркоза, на фоне которого проводили подкожные инъек­ции сразу после I серии тестирования в "открытом поле". Кроме того, повторное исследование крыс в актографе было отделено от 1 серии большим промежутком времени. Скорее всего, пове­денческая депрессия во II серии тестирования может рассмат­риваться как следствие стресса, обусловленного ингаляцией эфира и подкожной инъекцией. Правомерность этого предпо­ложения иллюстрируется достоверным приростом анксиоген­ной дефекации во II серии тестирования по сравнению с I.

Предварительная 4-кратная иммобилизация крыс увеличива­ла выраженность поведенческих сдвигов во II серии тестирования в "открытом поле". Это проявилось достоверным уменьшением груминга и нарастанием анксиогенной дефекации по сравнению не только с I, но и со II серией контроля (см. табл. 1). Одновре­менно наблюдали увеличение ориентировочной реакции по от­ношению к контролю, что соответствует данным о "сверхбдитель­ности" при тревожно-депрессивных состояниях [15].

Введение кеналога предварительно стрессированным жи­вотным снижало анксиогенную дефекацию и увеличивало по­казатель груминга в "открытом поле" (см. табл. 1). Скорее всего данный факт отражает корригирующее действие фармакологи­ческих доз ГКГ в отношении стрессиндуцированной гиперсек­реции центрального медиатора тревожности КЛ. Важно доба­вить, что во II серии тестирования показатели груминга и ори­ентировочной реакции у крыс, которым вводили кеналог после стресса, превышали соответствующие показатели животных, получавших кеналог без предварительных иммобилизаций. От­меченные различия отражают стрессиндуцированную тахифи- лаксию гипоталамуса и(или) гиппокампа к регуляторным сиг­налам ГКГ, которые замыкают "длинную петлю" отрицательной обратной связи в ГГНС. По-видимому, постстрессорное сниже­ние чувствительности к ГКГ касается не только нервной ткани, а носит генерализованный характер. Об этом свидетельствует параллелизм между стрессогенным уменьшением психотроп­ных эффектов кеналога и его гипоплазирующего влияния на ви­лочковую железу (табл. 2).

Стрессобусловленные сдвиги поведения крыс сопровожда­лись увеличением активности МАО в головном мозге (табл. 2). Данный сдвиг касается МАО-Б, так как использованный в ра­боте бензиламин является высокоселективным субстратом этой формы фермента [6, 12]. Важно добавить, что введение кеналога приводило к снижению активности МАО мозга у контрольных крыс и нормализовало церебральную активность фермента у предварительно стрессированных животных (см. табл. 2). Полу­ченный результат подтверждает ранее высказанное предполо­жение о постстрессорном снижении чувствительности к ГКГ как причине нарастания активности МАО в мозге [5]. Вполне возможно, что коррекция стрессогенных расстройств поведения крыс под действием кеналога (см. табл. 1) может быть опосре­дована через его нормализующее влияние на церебральную ак­тивность МАО. Правомерность приведенного рассуждения ил­люстрируется отрицательной корреляцией между активностью МАО мозга и показателем груминга у крыс, получавших кеналог после предварительных иммобилизаций (г = -0,68; р < 0,05). Данная корреляционная зависимость хорошо согласуется с представлениями о роли повышения активности МАО нервной ткани в развитии депрессивных расстройств и об их коррекции под действием фармакологических ингибиторов МАО [6, 8].

Стрессогенное увеличение активности МАО сопровожда­лось накоплением продуктов ПОЛ в головном мозге крыс (см. табл. 2). Это является следствием усиленной генерации суб- стратнезависимого продукта МАО-реакции - Н₂О₂, относя­щейся к числу мощных индукторов ПОЛ [9]. МАО-зависимое усиление ПОЛ в мозге может привести к повреждению ГКГ-ре- цепторов гиппокампа и(или) гипоталамуса, нарушить функцио­нирование отрицательной обратной связи в ГГНС и за счет это­го обусловить тревожные расстройства поведения. Правомер­ность этого предположения иллюстрируется прямой корреля­цией (г_к = 0,45; р < 0,05) между содержанием гептанраствори- мых ДК в мозге контрольных крыс и их анксиогенной дефека­цией во II серии тестирования. Важно подчеркнуть, что введе­ние кеналога предварительно стрессированным животным сни-

Табл и ца 1

Влияние повторных эпизодов иммобилизационного стресса и кеналога (2 мг/кг) на поведение крыс в "открытом поле" (М ± т)

Примечание. Здесь и в табл. 2: статистическую обработку проводили с использованием критериев Стьюдента, Вилкоксо­на-Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова; различия считали достоверными при р< - 0,05. Достоверность различий: ⁺ - между сериями I и II; * - между группами "контроль" и "стресс"; "контроль" и "контроль 4- кеналог"; ** - между группами "контроль + кеналог" и "стресс + кеналог"; ⁺⁺ - между группами "стресс" и "стресс + кеналог".

При ме ча ние. Представлены абсолютные значения активности МАО (в нМ бензальдегида/цельный орган/мин). Содержа­ние продуктов ПОЛ выражено в единицах индексов окисления; подстрочные символы "г" и "и" обозначают гептановую и изопро- панольную фазы липидного экстракта соответственно.

жало церебральный уровень продуктов ПОЛ одновременно с нормализацией активности МАО (см. табл. 2).

Введение кеналога контрольным крысам вызывало прирост содержания гептанрастворимых ДК в мозге на фоне одновре­менного уменьшения активности МАО (см. табл. 1,2). Вполне возможно, что стрессогенное усиление липопероксидации в нервной ткани является следствием не только активации МАО, но и нарастания уровня циркулирующих ГКГ. Неэтерифициро- ванные ацил гидроперекиси, экстрагируемые гептаном, являют­ся цитотоксическими интермедиатами ПОЛ [17] и вполне могут опосредовать цереброповреждающее действие избытка ГКГ [19], а также вызывать сопутствующие расстройства поведения. Справедливость последнего предположения иллюстрируется отрицательной корреляцией (г_к =■ -0,44; р < 0,05) между уров­нем гептанофильных ДК в мозге контрольных крыс, получав­ших кеналог, и показателем их ориентировочной реакции во время II серии тестирования в "открытом поле".

Особого внимания заслуживает сопоставление уровня про­дуктов ПОЛ в мозге контрольных крыс, получавших кеналог, и животных, которым вводили глюкокортикоидный препарат по­сле стресса (см. табл. 2). Как видно, серия предварительных им­мобилизаций уменьшала кеналогиндуцированное накопление гептанрастворимых ДК в мозге, снижала уровень гептанофиль­ных КД и СТ, но увеличивала содержание обеих категорий изо- пропанолрастворимых липопероксидов. Скорее всего получен­ные результаты отражают снижение активности фосфолипазы А₂, которая "вырезает" переокисленные полиеновые ациллы из структуры изопропанолэкстрагируемых фосфолипидов, вслед­ствие чего неэтерифицированные ацилгидроперекиси становят­ся гептанрастворимыми [7, 14]. Установленные факты свиде­тельствуют о постстрессорном снижении чувствительности моз­га к ПОЛ-опосредованному цереброповреждающему действию фармакологических доз ГКГ, так как неэтерифицированные интермедиаты липопероксидации обладают большей цитоток­сичностью по сравнению с эфирно-связанными продуктами ПОЛ [17]. Полученные данные позволяют сделать вывод о ПОЛ-ограничивающем действии предварительного стресса в условиях введения экзогенных ГКГ, которые в свою очередь уменьшают стрессиндуцированную активацию ПОЛ в нервной ткани (см. табл. 2).

Данный вывод справедлив не только в отношении мозга. Как видно, похожие закономерности проявляются в печени и почках крыс (см. табл. 2). В обоих случаях 4-кратный иммоби­лизационный стресс вызывает активацию ПОЛ, выраженность которой уменьшается под действием кеналога. Кеналогобуслов- ленные сдвиги ПОЛ у контрольных животных имеют органо­специфический характер. Введение кеналога контрольным кры­сам увеличивает содержание гептанрастворимых ДК в почках на фоне одновременного уменьшения уровня изопропанолраство- римых липопероксидов. Этот сдвиг может быть связан с дефи­цитом ограничительной регуляции фосфолипазы А₂ эндогенны­ми ГКГ, уровень которых снижается при введении фармаколо­гических доз глюкокортикоидного препарата. Подобный меха­низм описан в литературе как причина развития стероидных язв желудка [10]. Важно подчеркнуть, что стрессогенное снижение чувствительности к ГКГ препятствует кеналогиндуцированной модуляции ПОЛ в почках (см. табл. 2). Кеналогиндуцированное нарастание уровня ДК в гептановой фазе липидного экстракта печени сопровождается одновременным снижением содержа­ния КД и СТ, что отражает замедление окислительной деструк­ции ацилгидроперекисей и их конверсии во вторичные интер­медиаты липопероксидации. Предварительный стресс усугуб­лял этот сдвиг и приводил к параллельному нарастанию уровня изопропанолрастворимых продуктов ПОЛ.

Стрессогенное усиление ПОЛ в печени и почках было свя­зано с увеличением активности МАО; 4-кратная иммобилиза­ция крыс приводила к достоверному нарастанию активности фермента в почках и вызывала аналогичную тенденцию в пече­ни (см. табл. 2). При этом у стрессированных животных содер­жание гептанрастворимых ДК в почках прямо коррелировало с активностью МАО в них (г = 0,65; р < 0,05), а активность МАО в печени - с уровнем гептанофильных КД и СТ в этом органе (г ~ 0,7; р < 0,05). Следует подчеркнуть, что введение кеналога предварительно стрессированным животным приводило к па­раллельному снижению активности МАО и уровня липоперок­сидов в печени и почках, как и в мозге (см. табл. 2). Это свиде­тельствует об органонеспецифическом характере МАО-зависи- мой активации ПОЛ на фоне постстрессорного снижения чув­ствительности к ГКГ.

Не исключено, что активация МАО и ПОЛ в печени и поч­ках тоже играет определенную роль в развитии стрессогенных расстройств поведения. Такая возможность иллюстрируется по­ложительной корреляцией анксиогенной дефекации с активно­стью МАО печени (г = 0,61; р < 0,05) и отрицательной корре­ляцией с содержанием гептанофильных ДК (г = -0,69; р < 0,05) в почках крыс, получавших кеналог после стресса.

В целом полученные результаты позволяют рассматривать стрессиндуцированное снижение чувствительности к ГКГ как фактор активации МАО, сопровождающейся усилением ПОЛ и анксиогенными расстройствами поведения. Сделанный вывод касается МАО-Б, определяемой использованным методом [2, 12] и являющейся основной формой фермента в мозге и печени у крысы и человека [16, 18]. Нельзя исключить также, что стрес­согенное увеличение активности МАО-Б в некоторых тканях может быть связано не только с ослаблением МАО-ингибитор- ного действия кортикостероидов, но и с усилением ГКГ-зави- симой экспрессии фермента [13]. Такая возможность иллюст­рируется нарастанием активности МАО в почках контрольных крыс после введения кеналога (см. табл. 2).

Выводы

1. Повторные сеансы иммобилизационного стресса вызыва­ют анксиогенные расстройства поведения крыс, сопровождаю­щиеся снижением чувствительности животных к психотропным и тимусгипоплазирующим эффектам глюкокортикоидов.
2. Стрессиндуцированные расстройства поведения крыс со­провождаются увеличением активности МАО-Б и параллель­ным усилением липопероксидации в ткани головного мозга. Одновременно наблюдаются прирост активности МАО-Б в поч­ках, а также накопление переокисленных липидов в печени и почках крыс.
3. Введение кеналога (2 мг/кг) предотвращает постстрессор- ную активацию МАО-Б и ПОЛ, а также уменьшает выражен­ность анксиогенных расстройств поведения у крыс.